16SrRNA基因检测在支原体鉴定中的应用

2024年3月13日发(作者：标致308cc图片)

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ｎｉａＩ，ａｒｇｅ　ｏｕｔｂｒｅａｋ　ｏｆ　ｍｅａｓｌｅｓ　ｉｎ　ａ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　

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１７１　１７９．　

?

（收稿日期：２０１０　０７　１２）　

综　述?　

１　６Ｓ　ｒＲＮＡ基因检测在支原体鉴定中的应用　

李　淳综述，朱翠明，吴移谋审校　

（南华大学病原生物所，湖南衡阳４２１００１）　

关键词：基因，ｒＲＮＡ；　支原体，人型；　分子生物学　

ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１１．０１．０３６　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３—４１３０（２０１１）０１　００７５—０３　

支原体是能在无生命的培养基中生长的最小原核细胞型　

微生物。目前对支原体感染的实验室诊断方法主要是分离培　

养和血清学检测，但两种方法均存在一定的缺陷。随着对支原　

ＲＮＡ，它所含信息比５Ｓ　ｒＲＮＡ多且长度适中，又不像２３Ｓ　

ｒＲＮＡ序列太长而不易检测。１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因具有以下几个特　

点：（１）１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因几乎存在于所有的原核生物中，并且常　

作为多基因家族或操纵子存在，其编码基因长度约１　５００　ｂｐ，　

包含大约５Ｏ个功能域，足够用于信息学目的的研究ｌ１］。（２）在　

生物进化过程中，１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列变化非常缓慢，在结构　

体研究的不断深入，人们发现，兼有保守性和变异性于一体的　

１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因在支原体的鉴定和分类、分型方面有着无可比　

拟的优势和作用。现就此方面的研究现状作一简要综述。　

１　１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的分子特性　

１６Ｓ　ｒＲＮＡ是所有原核生物蛋白质合成必需的核糖体　

与功能上具有高度的保守性，可以用来标志生物的进化距离和　

亲缘关系，评价生物的遗传多态性和系统发生关系，在细菌分　

?

７６?　国际检验医学杂志２０１１年１月第３２卷第１期ｌｎｔ　Ｊ　！』　！　墼！　

类学中可作为１个科学、可靠的指标＿２］。（３）１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因　

将１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因用于ｌ临床标本中支原体的检测，具有灵　

具有高度稳定的保守区和可变区，可根据保守区设计通用引　

物，也可根据可变区设计特异性引物或探针，用于临床检测。　

２　１６Ｓ　ｒＲＮＡ在支原体种系发生和分类中的应用　

鉴于１６Ｓ　ｒＤＮＡ序列在支原体种系发生分类学中的重大　

敏、快速、不受使用抗生素的影响、与临床诊断吻合度高等优　

点，具有良好的应用前景。有学者用肺炎支原体１６Ｓ　ｒＲＮＡ基　

因Ｖ３区互补的３Ｏ个寡核苷酸探针进行杂交实验，有效地将　

其与口腔支原体、唾液支原体和人型支原体区分开。虽然此法　

检测生殖支原体亦呈阳性，但根据标本来源不同可鉴别肺炎支　

作用，柔膜体纲委员会推荐使用１６Ｓ　ｒＤＮＡ序列来描述任何新　

型的支原体。最近有研究显示，扩增１６Ｓ　ｒＤＮＡ的变性梯度凝　

胶电泳以及扩增１６Ｓ　ｒＤＮＡ限制分析（ＡＲＤＲＡ）在辨别支原体　

种属中的作用较大＿３　］。根据１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列，支原体目　

原体和生殖支原体。随着分子生物学的发展，许多实验室已经　

开始利用ＰＣＲ或套式ＰＣＲ针对不同特异性靶序列进行支原　

体ＤＮＡ的扩增协助诊断［５＿６］。ＰＣＲ或套式ＰＣＲ扩增检测支　

可以分成５类种系发生单位。无胆甾支原体属和厌氧支原体　

属被认为是从革兰阳性细菌进化而来的最早的柔膜体纲类细　

菌。螺原体属是由早期的无胆甾支原体属分支分裂进化而来，　

原体１６Ｓ　ｒＲＮＡ的关键，是针对不同支原体设计不同的引物　

３．１引物设计（１）在１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的保守区中设计引物：　

利用１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因保守区设计的通用引物，一次可扩增几乎　

并且支原体目和尿素支原体被认为含有螺原体属的祖先。１６Ｓ　

ｒＲＮＡ基因序列对柔膜体纲系统发生和分类中最重要的意义，　

就是将不能培养出来的植原体属作为与无胆甾支原体属关系　

密切的柔膜体纲特殊的单元分化单位。通过ＤＮＡ同源性、　

１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的限制性酶分析，１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列描绘了　

植原体属分化支中的１４个不同的亚分化支。　

３　１６Ｓ　ｒＲＮＡ在支原体临床检测中的应用　

表１　

所有支原体１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因片段，克服了传统ＰＣＲ扩增不同　

支原体需要设计不同引物的缺点，方便了临床支原体的检测，　

引物的设计具体可参考文献［４］。（２）在１６Ｓ　ｒＲＮＡ的变异区　

中设计引物：根据支原体１６Ｓ　ｒＲＮＡ的保守序列中存在支原体　

属特异性序列，而其多变序列中存在种特异性序列的特点，通　

过对多种支原体的１６Ｓ　ｒＲＮＡ序列进行对比分析后，可以设计　

出属特异性引物和种特异性引物。见表１。　

ｌ６Ｓ　ｒＲＮＡ基因中特异性引物序列　

３．２　ＲＴ－ＰＣＲ扩增特异性靶ＲＮＡ序列或ＰＣＲ和套式ＰＣＲ　

能特异性地检测出多种支原体，甚至支原体中特定的株。通过　

扩增特异性ＤＮＡ靶序列　１６Ｓ　ｒＲＮＡ／ＤＮＡ基因序列表现为　

属、种，甚至株层次上差异，因而特异性的ＲＴ－ＰＣＲ／ＰＣＲ技术　

使用敏感度高的套式ＰＣＲ技术，靶向扩增保守１６Ｓ　ｒＤＮＡ基　

因，可提高支原体检测的特异性和灵敏度，关于套式ＰＣＲ引物　

国际检验医学杂志２０１１年１月第３２卷第１期Ｉｎｔ　Ｊ　Ｌａｈ　Ｍｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ　２０１１，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１　

?　

７７?　

的设计具体可参考文献［７］。　

３．３　１６Ｓ　ｒＲＮＡ／ＤＮＡ基因的检测方法　（１）琼脂糖凝胶电　

泳：琼脂糖凝胶电泳是分离ＰＣＲ扩增产物的常规方法。该技　

体的鉴定和系统发育关系的研究。ＡＲＤＲＡ技术的原理是基　

于ＰＣＲ技术选择性扩增ｒＤＮＡ片段，如１６Ｓ　ｒＤＮＡ，再对１６Ｓ　

ｒＤＮＡ片段进行限制性酶切片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）。理　

术操作简便快速，可以分辨用其他方法（如密度梯度离心法）所　

无法分离的ＤＮＡ片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙　

论上，研究发现扩增性１６Ｓ　ｒＤＮＡ限制性酶切片段分析方法可　

以区分鉴定所有的支原体。　

４结　语　

啶（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ，ＥＢ）染色，在紫外光下至少可以检出１～　

１０　ｎｇ的ＤＮＡ条带，从而可以确定ＤＮＡ片段在凝胶中的位置　

目前，虽然几乎所有的支原体都可以用１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因分　

析加以鉴定，但仍然存在许多相关的问题有待解决：（１）由于　

１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因具有高度保守性的特点，决定了它在实际应用　

并进行物种鉴定。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的　

ＤＮＡ条带，用于以后的克隆技术操作。（２）ＤＮＡ测序：在分子　

生物学研究中，ＤＮＡ的序列分析是进一步研究和改造目的基　

因的基础。目前用于测序的技术主要有Ｓａｎｇｅｒ等发明的双脱　

氧链末端终止法和Ｍａｘａｍ、Ｇｉｌｂｅｒｔ发明的化学降解法。这两　

中易存在污染而造成假阳性的问题。（２）虽然１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因　

序列分析在临床或公共卫生方面的支原体鉴定作用很大，但是　

研究表明１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列并不是完美的，并且不是任何情　

况都可以应用。对于生长或鉴定有困难的支原体，临床上传统　

的实验方法鉴别率高于１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列分析。（３）虽然　

１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列对于支原体的分类鉴定有很大的作用，但　

是它的物种级别的种系发生能力很低，对于一些属的区分能力　

种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点　

开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生Ａ、Ｔ、ｃ、Ｇ　４组不　

同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的ＰＡＧＥ凝胶上电　

泳检测，从而获得ＤＮＡ序列鉴定支原体的种类。目前Ｓａｎｇｅｒ　

测序法得到了广泛的应用。（３）变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）和　

温度梯度凝胶电泳（ＴＧＧＥ）：长度相同的１６Ｓ　ｒＤＮＡ序列由于　

含有的碱基不同，各片段变性时所需要的变性剂浓度和Ｔｍ值　

也很弱，并且ＤＮＡ亲缘关系的研究必须对这些分类学问题提　

供绝对的分辨率。不过，１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的检测在支原体的鉴　

定和分类中还是很有前景的１种快速诊断方法。相信随着医　

学和分子生物学的发展，这些问题在未来会得到很好的解决。　

参考文献　

　ＳＬ．１６Ｓ　ｒＲＮＡ　Ｇｅｎｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｆｏｒ　

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Ｊａｎｄａ　ＪＭ，Ａｂｂｏｔｔ

Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｐｌｕ～　

也就不同。ＤＧＧＥ或ＴＧＧＥ就是应用这种差异来区分不同的　

支原体基因序列。这种电泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰基　

ＤＧＧＥ，从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度ＴＧＧＥ。　

电泳中的ＤＮＡ到达它的变性温度时，双链部分解开，造成泳　

动速度发生变化，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带，从　

而达到分离效果。每个条带代表１个特定序列的１６Ｓ　ｒＤＮＡ　

片段。此技术的关键就是引物ＧＣ夹的设计，目前，用此技术　

分析支原体１６Ｓ　ｒＤＮＡ基因时，其ＰＣＲ扩增所用ｋ游引物普　

遍使用细菌通用引物扩增１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因Ｖ３区，而下游引物　

则用支原体的特异性引物进行检测ｃ８］。ＤＧＧＥ技术快速简便、　

分离效果好，可对等长的ＰＣＲ产物进一步的分离，提高了支原　

ｓｅｓ，Ｐｅｒｉｌｓ，ａｎｄ　Ｐｉｔｆａｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，４５（９）：　

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ｃｋｙ　Ｍ，Ｍａｎｕｅｌａ　ＲＣ，Ｐｉｅｒｒｅ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｍａｓｓｉｖｅ　ｃｏｍｐａｒａ—　

［２３　

Ｖｉ

ｔｉｖｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅ—　

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ＤＮＡ序列分析技术在微生物分类鉴定中的　

［３］　

雷正瑜．１６Ｓ　ｒ

应用Ｉ－Ｊ］．湖北生态工程职业技术学院学报，２００６，４（１）：４—　

７．　

体分类鉴定的准确性。（４）ＤＮＡ多态性分析：ＤＮＡ多态性分　

析方法有多种，如单链构象多态性分析（ＳＳＣＰ）、末端限制性片　

段长度多态性分析（Ｔ　ＲＦＬＰ）等。通过分析揭示样品种类、数　

量和种群大小等信息，从而解析样品的结构、功能及动态变化，　

达到诊断鉴别样品中是否存在支原体的目的。１６Ｓ　ｒＲＮＡ基　

因保守区是理想的引物目标识别区，而可变区对微生物种类的　

ｅｃａ　Ｊ，Ｂｕｔａｙｅ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍ—　

［４］　

Ｓｔａｋｅｎｂｏｒｇ　Ｔ，Ｖｉ

ｐｌｉｆｉｅｄ　ｒＤＮＡ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＲＤＲＡ）ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉ—　

ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２００５，　

５（１）：４６．　

鉴别有意义，其变异性导致的ＤＮＡ片段构象很容易被ＳＳＣＰ　

证实。Ｔ—ＲＦＩ　Ｐ是对标本中核酸的核糖体序列进行扩增，由于　

　ＣＴ，Ｇｌａｓｓ　ＭＢ，ｅｔ　ａ１．Ｕｓｅ　ｏｆ　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　

［５］　

Ｇｅｅ　ＪＥ，Ｓａｃｃｈｉ

ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ—　

特异的限制性核酸内切酶在核糖体序列位置的不同，可以产生　

具有不同长度的扩增片段，这些带有各种信息的片段被经典荧　

光标志，因此可以在ＤＮＡ测序仪上被检测到。（５）核酸　

ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ　ａｎｄ　Ｂ．ｍａｌｌｅｉ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，４１（１Ｏ）：４６４７—４６５４．　

　Ｐ，Ｒａｏｕｌｔ　Ｄ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　

［６］　

Ｄｒａｎｃｏｕｒｔ　Ｍ，Ｂｅｒｇｅｒ

ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　２７　

（ＲＮＡ）印迹杂交与基因芯片技术：ＲＮＡ印迹杂交又称Ｎｏｒｔｈ—　

ｅｒｎ印迹杂交，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂ１ｏｔ是１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列分析最常　

用的技术之一。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ技术的集成化产生了基因芯片　

技术。ＤＮＡ芯片的优点是可快速、准确、高效地显示病原体的　

ｎｅｗ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，４２（５）：２１９７—２２０２．　

［７］　

糜祖煌，秦玲．发酵支原体和穿透支原体双重套式ＰＣＲ　

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ｆｆｅ，Ｅｌｌｉｓ　ＲＪ，Ｌａｗｅｓ　ＪＲ，ｅｔ　ａ１．１６Ｓ　ｒＤＮＡ　

［８］　

Ｌａｕｒａ　ＭｃＡｕｌｉ

ＰＣＲ　ａｎｄ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ａ　ｓｉｎｇｌｅ　

ｇｅｎｅｒｉｃ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　

遗传信息，已广泛应用于基因序列分析、支原体感染的快速诊　

断、变异及耐药机制的研究，以及基因分型、分子流行病学调查　

和抗感染药物的研制等。对多态性和突变检测型基因芯片，采　

用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及　

检测范围。（６）扩增性１６Ｓ　ｒＤＮＡ限制性酶切片段分析方法　

（ＡＲＤＲＡ）鉴定支原体：ＡＲＤＲＡ是美国最新发展起来的１项　

现代生物技术，此方法简单、普遍且不受菌株是否纯培养物的　

限制，具有特异性强、效率高的特点，因此可以广泛地用于支原　

ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，５４（Ｐｔ８）：７３１－７３９．　

（收稿日期：２０１０　０２—０５）