5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10基因启动子的去甲基化作用

2024年1月10日发(作者：交通违章查询大厅)

5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10基因启动子的去甲基化作用

汪茗;章尧;谢向荣;刘善浩;戚之琳;毕富勇

【摘 要】To explore the demethylation effect of 5-aza-2\'-deoxycytidine(5-Aza-dC) on the promoter region of RASSF10 gene in Molt-4 cells in vitro,

Molt-4 cells were cultured in vitro and treated with 5-Aza-dC. The cell

proliferation inhibition rate was evaluated by MTT assay. RT-PCR was

applied to detect RASSF10 mRNA expression. Western blot was applied to

detect RASSF10 protein expression. COBRA was applied to detect the

methylation state of the promoter region of RASSF10 gene in Molt-4 cells.

Results showed that the proliferation inhibition rate induced by 2.5 μmol/L,

5 μmol/L, 10 μmol/L 5-Aza-dC was obviously higher than that in control in

a dose-and time-dependent manner. The mRNA and protein expression of

RASSF10 gene couldn\'t be found in Molt-4 cells of control. However, after

treating with 5-Aza-dC, they could be detected in Molt4- cells. The

promoter region of RASSF10 gene was hyperm-ethylated in control.

However, after treating with 5-Aza-dC, methylated RASSF10 gene in Molt-4 cells was partially demethylated. 5-Aza-dC can inhibit the proliferation of

Molt-4 cells in vitro and increase the mRNA and protein expression of

RASSF10 gene.%探讨甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2\'deoxycytidine,5-Aza-dC)对人急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞的增殖抑制作用及对RASSF10基因启动子甲基化状态的影响.体外培养Molt-4细胞,采用不同浓度5-Aza-dC对Molt-4细胞进行处理.采用MTF法检测细胞增殖抑制率,RT-PCR

法检测RASSF10 mRNA表达的变化,Western blot检测RASSF10蛋白表达的变化,COBRA实验检测RASSF10甲基化水平.一定浓度的5-Aza-dC作用Molt-4细胞后,细胞增殖抑制率显著升高,且具有时间和剂量依赖性.对照组Molt-4细胞未检出RASSF10 mRNA及蛋白表达,而5-Aza-dC处理组检出RASSF10基因重新表达.COBRA实验结果提示对照组Molt-4细胞中存在启动子高甲基化的现象,而5-Aza-dC处理组Molt-4细胞的RASSF10基因被部分去甲基化.甲基化抑制剂5-Aza-dC可通过对RASSF10基因的去甲基化作用,重新恢复RASSF10的表达,从而抑制Molt-4细胞的增殖.

【期刊名称】《生物学杂志》

【年(卷),期】2013(030)001

【总页数】4页(P18-21)

【关键词】去甲基化;白血病;5-氮杂-2’-脱氧胞苷;RASSF10基因

【作 者】汪茗;章尧;谢向荣;刘善浩;戚之琳;毕富勇

【作者单位】皖南医学院生化教研室,芜湖241002;皖南医学院生化教研室,芜湖241002;弋矶山医院心内科,芜湖241001;弋矶山医院血液内科,芜湖241002;皖南医学院生化教研室,芜湖241002;皖南医学院生化教研室,芜湖241002

【正文语种】中 文

【中图分类】R733.7

DNA甲基化异常作为一种表观遗传学现象，是细胞癌变过程中的早期、频发事件，并且是一个可逆的生物学过程。因此甲基化的特异基因可作为肿瘤早期诊断、治疗

的分子标志，而对特异基因进行去甲基化处理则可以达到治疗肿瘤的目的 [1-2]。RASSF10是最近鉴定出的RASSF家族的新成员[3]。已有报道提示RASSF10的启动子甲基化在甲状腺癌、前列腺癌[3-4]等肿瘤中频繁出现。本研究以人急性淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞为研究对象，采用MTT、RT-PCR、Western blot、COBRA等方法研究甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′deoxycytidine，5-Aza-dC)对Molt-4细胞的增殖、RASSF10 mRNA、蛋白表达及RASSF10基因启动子甲基化状态的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人急性淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞购自中科院上海细胞生物研究所。

1.1.2 试剂 5-Aza-dC购自Sigma公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；RNA提取、RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司；基因组DNA提取试剂盒购自Qiagen公司；DNA甲基化试剂盒购自Millipore公司；DNA marker 及引物均购自上海生工公司；RASSF10多克隆抗体购自Abgent公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，将Molt-4细胞置于37℃，5% CO2饱和湿度的孵箱中培养。倒置显微镜下观察细胞生长状况。

1.2.2 MTT(四唑盐比色法) 取对数生长期细胞，调整浓度为1×105/mL，接种于96孔板。5-Aza-dC作用24、48、72 h后取出培养板，每孔加入MTT(5 g/L)20

μL, 37℃继续培养4 h后，离心弃上清，加DMSO 150 μL,震荡后酶标仪570 nm下测定各孔的吸光度A，按下式计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率(%)=(A对照-A实验)/A对照×100%

1.2.3 RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应) 5-Aza-dC作用72 h后，Trizol提取总

RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度(A260/A280>1.8)。两步法RT-PCR按试剂盒说明进行扩增。RASSF10上游引物:5′-GCGCCATGGATCCTTCGGAAAA-3′，下游引物: 5′-GGCAGCGCCTCGTCGTC GTCCT-3′，产物244 bp。GAPDH为内参，上游引物:5′-TGAAGGTCGGAGTCA ACGGATT TGGT-3′，下游引物：5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′，产物984 bp[4]。扩增条件：95℃预变性 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 10 min，4℃维持。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，捷达801凝胶成像分析系统对结果进行分析。用ARASSF10/AGAPDH表示RASSF10 mRNA相对水平。

1.2.4 Western blot(免疫印迹法) 收集5-Aza-dC处理72 h后Molt-4细胞的总蛋白，按100 μg/孔上样。10% SDS-PAGE电泳后转膜至NC膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，封Ⅰ抗RASSF10 (1∶500)4℃过夜。次日TBST、TBS洗膜。封HRP标记的羊抗兔Ⅱ抗(1∶2000)45 min，同法洗膜。ECL化学发光，将膜置于暗盒中，暗室内胶片曝光，冲洗胶片。

1.2.5 COBRA(亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法) 取对照组及10 μmol/L 5-Aza-dC处理72 h后的Molt-4细胞，按DNA提取说明书提取各组细胞基因组DNA，并进行 DNA纯度测定：A260/A280>1.8。按DNA甲基化试剂盒说明书对DNA进行修饰及纯化，并取亚硫酸氢钠修饰的DNA 进行半巢式PCR扩增。扩增方法参考文献[4]。其外部引物RASSF10 COU1:5′-ATAAGTAGAGGAGTTAGTAGGTTAAAGGAGA-3′，RASSF10 COL1: 5′-CCCCCAAAACC CAAAACTATAACTAA A-3′；半巢式PCR内部引物为

RASSF10 COL2: 5′-A AATACAAA AAACTCAA AACCCAA ACCC-3′和

RASSF10 COU1[4]。取PCR 产物(241bp)用10 U TaqI进行消化，将产物进行2%

琼脂糖凝胶电泳。结果判断：样本出现消化的短链DNA条带者说明该基因启动子区存在甲基化，PCR后具有TaqI识别位点，可被TaqI识别并水解；样本未出现

消化短链DNA条带者为基因启动子区不存在甲基化，PCR后没有TaqI识别位点，不能被水解；结果介于两者之间的为该基因启动子存在部分甲基化。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.5进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，组内比较用t检验，P<0.05有显著性差异。

2 结果

2.1 5-Aza-dC对Molt-4细胞增殖的影响 如图1所示，Molt-4细胞经3种不同浓度5-Aza-dC处理后，细胞增殖抑制率均高于对照组，差异有统计学差异(P<

0.01)，且不同浓度组之间的区别亦具有统计学意义(P<0.05)。结果提示，5-Aza-dC对Molt-4细胞增殖的抑制作用呈现时间、剂量依赖性。

2.2 5-Aza-dC对RASSF10 mRNA表达的影响 如图2所示，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，RASSF10 mRNA在对照组Molt-4细胞中不表达，而经过2.5、5、10 μ mol/L的5-Aza-dC处理后可见RASSF10 mRNA恢复表达，RASSF10表达强度与5-Aza-dC的浓度呈剂量依赖关系。RASSF10相对表达量用ARASSF10/AGAPDH表示，结果如表1所示，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 5-Aza-dC对Molt-4细胞增殖的影响Fig 1 Effect on the proliferation of

Molt-4 cells induced by 5-Aza-dC**—P<0.01 vs control.

图2 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10 mRNA 表达的影响Fig 2 Effect of 5-Aza-dC on the expression of RASSF10 mRNA in Molt-4 cells1—marker；2—control；3—2.5 μ mol/L5-Aza-dC；4—5 μ mol/L5-Aza-dC；5—10 μ

mol/L5-Aza-dC.

表1 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10 mRNA表达的影响Table 1 Effect of

5-Aza-dC on the mRNA level of RASSF10 in Molt-4 cells(x±s, n=3)组别ARASSF10/AGAPDHcontrol0 000±0 0002 5μmol/L5?Aza?dC0 055±0

006?5μmol/L5?Aza?dC0 261±0 025??10μmol/L5?Aza?dC0 779±0 033??

*—P<0.05, **—P <0.01 vs control.

图3 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10蛋白表达的影响Fig 3 Effect of 5-Aza-dC on the expression of RASSF10 protein in Molt-4 cells1—control；2—2.5

μ mol/L5-Aza-dC；3—5 μ mol/L5-Aza-dC；4—10 μ mol/L 5-Aza-dC.

表2 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10蛋白表达的影响Table 2 Effect of 5-Aza-dC on the protein level of RASSF10 in Molt-4 cells(x±s, n=3)组别A′RASSF10/A′GAPDHcontrol0 000±0 0002 5μmol/L5?Aza?dC0 098±0

015?5μmol/L5?Aza?dC0 317±0 028??10μmol/L5?Aza?dC0 961±0 053??

*—P<0.05, **—P <0.01 vs control.

2.3 5-Aza-dC对RASSF10蛋白表达的影响 由图3，表2可见，对照组及5-Aza-dC各浓度组细胞的内参GAPDH表达量无显著区别，而对照组细胞无RASSF10表达，5-Aza-dC各处理组的RASSF10蛋白表达量显著上调，与5-Aza-dC浓度有关，差异有统计学意义(P< 0.05)。

2.4 5-Aza-dC对RASSF10基因启动子甲基化状态的影响 COBRA实验检测Molt-4细胞采用5-Aza-dC处理前后RASSF10基因启动子区域甲基化状态，结果如图4所示。对照组消化的DNA条带明显，说明对照组存在启动子甲基化现象，PCR扩增后含有TaqI识别位点，可被TaqI消化水解，出现水解条带。而经10

μmol/L 5-Aza-dC作用72 h后的处理组，可见清晰的未被TaqI消化水解的条带，消化水解的DNA条带不明显。说明启动子有甲基化和非甲基化共存的现象，原先甲基化的RASSF10基因启动子区域大部分被去甲基化了。

图4 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10基因启动子甲基化的影响Fig 4 Effect

of 5-Aza-dC on the promoter region of RASSF10 gene in Molt-4 cells1—10

μ mol/L 5-Aza-dC处理组；2—control.

3 讨论

肿瘤基因启动子区域DNA甲基化是遗传外修饰调控的一种重要方式，它可引起基因表达沉默，从而下调抑癌基因表达，导致肿瘤的发生。近年来，越来越多的研究显示人类众多肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，基因启动子区CpG岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生，这也是白血病发病的重要机制之一[2,5-6] 。

Ras相关结构域家族(Ras-association domain family,RASSF)则是Ras激活信号转导通路中的一组负向调节基因，通过调控细胞周期和细胞凋亡而介导肿瘤抑制效应。RASSF至少包括10个成员：RASSF1-10。其中RASSF1-6属于“经典成员”，都含有C末端的RA(Ras-association)结构域和SARAH(Sav/RASSF/Hippo)结构域。而RASSF7-10的N末端都含有RA结构域但是缺乏SARAH结构域，因此被称为“N端RASSF家族”[7-8]。它们参与了很多关键的生物学过程，比如：细胞死亡、增殖、微观的稳定性、启动子的甲基化、对缺氧的反应等。RASSF10是“N端RASSF家族”的新成员，是新近被鉴定出的含一个单独的外显子基因，位于11 p15.2，含有一个大的CpG岛，覆盖了这个基因的大部分[7-10]。目前已有文献报道在人类众多肿瘤中发现RASSF的一些成员频繁失表达，且认为RASSF基因启动子的甲基化是其失表达的重要原因[7-13]。但有关RASSF10甲基化与白血病相关性的研究还比较少，关于急性白血病RASSF10启动子甲基化的研究尚处于初级阶段，本研究探讨了甲基化抑制剂5-Aza-dC在体外对白血病细胞株Molt-4细胞的增殖抑制作用及对RASSF10基因启动子甲基化的影响。

5-Aza-dC是常用的DNA甲基转移酶抑制剂，可通过抑制DNA甲基转移酶1(DNMT1)的甲基转移活性而发挥去甲基化作用。已有研究报道5-Aza-dC可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而使抑癌基因恢复其抑癌的功能。以往研究发现，多个基因启动子区域甲基化而失活的抑癌基因被5-Aza-dC处理

后可被重新激活，如RASSF1A基因[14]、p16基因[15]等。本研究采用5-Aza-dC处理急性淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞，研究发现经过不同浓度5-Aza-dC处理后，Molt-4细胞增殖均受到了明显抑制，5-Aza-dC具有显著抑制白血病细胞增殖的作用。为进一步探讨5-Aza-dC抑制白血病细胞增殖的作用机制，本研究还继续观察了其对抑癌基因RASSF10基因启动子甲基化状态产生的影响。为减少因5-Aza-dC自身对细胞的毒性作用而对实验结果产生的影响，本研究选用的是3种较小的有效浓度来处理Molt-4细胞，结果显示在对照组Molt-4细胞中RASSF10基因启动子是被甲基化修饰的，RASSF10 mRNA、蛋白在Molt-4细胞中不表达，但经过10 μ mol/L 5-Aza-dC处理后，RASSF10基因启动子部分发生去甲基化作用，其RASSF10 mRNA、蛋白重新出现表达，证明了RASSF10基因启动子的高度甲基化修饰是导致抑癌基因RASSF10失表达的主要机制。5-Aza-dC可通过使抑癌基因RASS F10基因发生去甲基化作用，进而使RASSF10重新恢复表达而发挥抗白血病效应。

综上，本研究结果提示甲基化抑制剂5-Aza-dC能使急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞RASSF10基因的甲基化程度降低，诱导其重新表达，从而抑制了Molt-4细胞的增殖。实验结果既为RASSF10作为白血病治疗新靶点的确认提供了理论依据，也为急性白血病的去甲基化治疗提供了理论基础。

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