阿魏酸通过胰岛素IGF信号通路和DAF-16促进秀丽隐杆线虫寿命和应激抵抗

2024年4月7日发(作者：本田锋范和飞度哪个好)

第42卷

2021年

第2期

3月

JOURNALOFSUNYAT?SENUNIVERSITY（MEDICALSCIENCES）

中山大学学报（医学科学版）

Vol.42

March2021

No.2

阿魏酸通过胰岛素/IGF信号通路和DAF-16促进

秀丽隐杆线虫寿命和应激抵抗力

况琪斐

1

，陈巧超

1

，张玲

1

，何文

1

，裴中

2

（1.中山大学附属第一医院老年医学科，广东广州510080；2.中山大学附属第一医院神经内科，广东广州510080）

摘要：【目的】观察阿魏酸对秀丽隐杆线虫寿命及应激抵抗能力的影响，探究其可能机制。【方法】使用秀丽

隐杆线虫作为抗衰老模型，给予不同浓度的阿魏酸（0、1、10、50mmol/L），探究其对线虫寿命、抗应激能力、脂褐素水

平的调控作用；使用qPCR筛选衰老相关基因，采用daf-2（DR1572）、daf-16（CF1038）突变体线虫，对阿魏酸的潜在

作用机理进行初步探讨。【结果】与空白对照组相比，阿魏酸能明显延长秀丽隐杆线虫寿命并提高抗氧化应激和热

应激能力（P＜0.001），抑制与衰老相关的脂褐素的沉积（P＜0.001），同时不影响生育力和发育（P＞0.05）。用50

mmol/L阿魏酸组喂养线虫后，daf-2、akt-2和age-1基因的mRNA表达水平下调（P＜0.05），daf-16基因的mRNA表

达水平上调（P＜0.05），并上调其下游靶基因sod-3、clk-2的mRNA表达，以及下调ctl-1、dod-17的mRNA表达（P＜

（DR1572）、daf-16（CF1038）突变体线虫在50mmol/L阿魏酸处理后，寿命未见明显延长（P＞0.05）。【结论】阿魏酸

可通过胰岛素/IGF信号通路，促进DAF-16的核定位，提高机体应激抵抗能力，并延长线虫寿命。

关键词：阿魏酸；胰岛素/IGF信号通路；DAF-16；衰老；秀丽隐杆线虫

中图分类号：R592文献标志码：A文章编号：1672-3554（2021）02-0193-09

0.05）。50mmol/L阿魏酸处理后DAF-16：：GFP在细胞核定位的线虫比例从（5.3±1.5）%增加到（28±3）%。daf-2

FerulicAcidPromotesLongevityandStressToleranceviatheInsulin/IGFSignalingPath?

wayandDAF-16inCaenorhabditisElegans

KUANGQi-fei

1

，CHENQiao-chao

1

，ZHANGLing

1

，HEWen

1

，PEIZhong

2

Correspondenceto：HEWen；E-mail：***************.

（mentofGeriatrics，theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510080，China；?

mentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510080，China）

Abstract：【Objective】ToinvestigatetheeffectonlifeextensionandthemechanismofferulicacidinCaenorhabditis

elegans.【Methods】sasananti-agingmodel，anddifferentconcentrationsofferulicacid（0，1，10，50

mmol/L）weregiventoexploreitsregulatoryeffectsonthelifespan，anti-stressability，s.

AndweusedqPCRtoscreensenescencerelatedgenes，andDAF-2（DR1572）andDAF-16（CF1038）mutantswere

usedtoinvestigatethepotentialmechanismofferulicacid.【Results】Comparedwiththeblankcontrolgroup，ferulicacid

sandincreaseditsantioxidantandthermalstress（P＜0.001），inhibitedthe

feedingnematodeinthe50mmol/Lferulicacidgroup，mRNAexpressionlevelsofDAF-2，Akt-2andAGE-1geneswere

down-regulated（P<0.05），mRNAexpressionlevelsofDAF-16geneswereup-regulated（P＜0.05）andtheexpression

levelsofitsdownstreamtargetgenessod-3，ctl-1，clk-2anddod-17wereactivated（P＜0.05）.After50mmol/Lferulic

accumulationoflipofuscinrelatedtoaging（P<0.001），anddidnotaffectitsfertilityandbodyshape（P＞0.05）.After

收稿日期：2021-01-06

基金项目：国家自然基金（81671102）；广州市科技计划项目（2）

作者简介：况琪斐，在读硕士生，研究方向：衰老与认知，E-mail：******************.；何文，通信作者，教授，硕士生导师，E-mail：

***************.

194

中山大学学报（医学科学版）

第42卷

acidtreatment，theproportionofdaf-16：：GFPinthenematodecellnucleusincreasedfrom（5.3±1.5）%to（28±3）%.

ThelifespanofDAF-2（DR1572）andDAF-16（CF1038）mutantnematodeswasnotsignificantlyextendedaftertreat?

mentwith50mmol/Lferulicacid（P＞0.05）.【Conclusions】Ferulicacidcanpromotethenuclearlocalizationofdaf-16

throughinsulin/IGFsignalingpathway，improvethestressresistingabilityoftheorganism，andprolongthelifespanof

nematode.

Keywords：ferulicacid；insulin/IGFsignalingpathway；DAF-16；aging；s

［JSUNYat?senUniv（MedSci），2021，42（2）：193-201］

衰老和疾病是生命科学领域的热门研究领域。

衰老的本质是由于被动的随机错误积累（随机老化

理论）或主动的非随机过程（程序老化理论）导致身

体结构和功能随年龄而发生的退化

［1］

。许多与年

龄有关的疾病，包括癌症、心血管疾病和神经退行

性疾病，将变得越来越普遍

［2］

。如果能够有效地控

制衰老的进程，那么疾病的数量将减少，人类的寿

命和健康状况将得到有效改善。迄今为止，虽然药

物干预在延缓衰老方面已经取得了一定的效果，但

目前还没有获得国家药监局批准的抗衰老药物，因

此寻找天然有效的抗衰老药物十分重要

［3］

。秀丽

隐杆线虫（Caenorhabditiselegans，s）是研究

衰老的经典生物学模型。秀丽隐杆线虫具有寿命

短，易于培养，体积小的优点

［4］

。此外，在秀丽隐杆

线虫的基因中已鉴定出近80％的人类基因同源

物。最近的研究表明，特定的遗传和环境因素影响

线虫的衰老和寿命

［5］

。特别注意的是，秀丽隐杆线

虫与人类具有相似的衰老方面，其中寿命的延长与

压力的承受能力有关

［6］

。因此，秀丽隐杆线虫作为

模型生物，在鉴定可能有益于长寿的化合物和机制

方面具有很高的价值。阿魏酸（ferulicacid，FA；3-

甲氧基-4-羟基肉桂酸）是大麦颗粒、麦麸、大米胚

乳、玉米糠等植物细胞壁中常见的多酚类化合

物

［7］

。它通过酯键与多糖共价连接

［8］

。在植物细胞

壁中，脂肪酸可通过阿魏酸酯酶的作用释放出

来

［9］

。阿魏酸具有广泛的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等

生物活性

［10］

。阿魏酸在日本被用作食品添加剂的

抗氧化剂和食品防腐剂

［11］

。在中国，治疗者们利用

阿魏酸的抗氧化性，使用阿魏酸钠治疗心血管和脑

血管疾病

［12］

。阿魏酸可调控促炎性NF-κB及其相

关的基因信号，从而减弱老年大鼠中氧化应激引起

的炎症相关疾病

［13］

，也可通过激活中央毒蕈碱和烟

碱样受体和抗氧化酶，从而减少认知缺陷的进

展

［14］

。然而，其在延长寿命和抗衰老机制方面的研

究甚少，本研究以秀丽隐杆线虫为模型，对阿魏酸

的延缓衰老机制做进一步研究。

1材料与方法

1.1

阿魏酸

材料和仪器

（分子式：C

10

H

10

O

4

，分子质量：194.18）购

自

OP50

美国Sigma公司；大肠

体线虫

、野生型

daf-2（DR1572

N2秀丽隐杆线虫

杆菌

）、daf-16（

（

（

CF1038

C.

Escherichia

elegans

）由线虫遗

）、突变

coli）

传中心（norhabditisGeneticsCenter，CGC）提供并保

存

KH

于

PO

本实验室；胰蛋白胨、琼脂粉、NaCl、CaCl

2

、

24

、K

2

购自上海萨恩科技有限公司；

HPO

4

、MgSO

4

·7H

2

O、

Trizol

酵母提取物、

试剂、cDNA

胆固醇

反

转录试剂盒、SYBRGreen购自南京建成生物工程研

究所。

reaction

MyCycler聚合酶链式反应（polymerasechain

国Bio-Rad

，PCR

公司；

）仪、

智能恒温培养箱，

MyiQ2实时荧光定量

宁波海曙赛福

PCR仪，美

实验仪器厂；Neofuge13R台式高速冷冻离心机，力

康发展有限公司；NewClassicMS电子天平，上海奕

宇电子科技有限公司；SMZ-168显微镜，麦克奥迪

实业集团有限公司；U-RFLT50型荧光显微镜，日

本

1.2

Olympus公司。

固体培养基

秀丽隐杆线虫同步化

（nematodegrowthmedia，NGM）配

制：

mL

称

蒸

4.0

馏水

g琼脂、

溶解摇

0.5

匀

g

。

蛋白胨、

121℃

0.6

高压

gNaCl

蒸汽

加入

灭菌

195

min，温度降至

20

醇溶液、

200

1mol/L

60

MgSO

℃左右，加入5mg/mL胆固醇乙

4

溶液、1mol/LCaCl

2

溶液各

用

EP

M9

?L

缓冲溶液收集生长健康无染的

，pH6.0磷酸氢钾缓冲液5mL，倒板备用。

加入裂解液

管中，反复离心清洗

（0.5mol/L氢氧化钠和

3~5次，弃上清。每管线虫

L4期线虫到

2.5%次氯酸），

第2期

况琪斐，等.阿魏酸通过胰岛素/IGF信号通路和DAF-16促进秀丽隐杆线虫寿命和应激抵抗力

195

裂解8min，1000r/min，离心2min，离心机半径r=

17cm，弃上清，用M9反复清洗5次，加入M9在

机半径r=17cm，弃上清，转移至含有OP50大肠杆

20℃恒温培养2d，即得同期化L4期幼虫。

1.3寿命测定

20℃恒温静置12h，1000r/min，离心1min，离心

菌的线虫培养基（nematodegrowthmedium，NGM），

条至加药组（1、10、50mg/mLFA）与对照组，预先培

养6d后进行应激实验。在急性氧化应激实验中，

线虫暴露于每10mL含10?L30mmol/L双氧水的

部死亡为止。实验重复3次，整理数据并作图。

1.5体长和脂褐素积累分析

NGM培养基中，每小时统计1次寿命，直到线虫全

将同期化的野生型N2线虫随机挑取30条至

首先，使用阿魏酸对大肠杆菌OP50增殖的影加药组（1、10、50mg/mLFA）与对照组，预先培养5

d后，将线虫放在载玻片滴有1％琼脂糖垫上，并用

NaN

（）麻醉。在荧光显微镜下观察线虫

3

20?mol/L

响评估毒性试验，以确定所有实验均在无毒浓度下

进行。在20℃室温下，将线虫在接种有大肠杆菌

OP50的NGM（线虫生长培养基）平板上培养到产卵

期，然后使用强酸强碱溶液处理获得同步线虫。将

mmol/LFA）与对照组，此时记为第0天，20℃下培

（激发波长：340~380nm；发射波长：430nm，10×）。

使用ImageJ8.5软件测量线虫的荧光强度和体长。

实验重复3次，整理数据并作图。

1.6

将同步化的L4期野生型N2线虫，随机挑取

产卵实验

同步化的线虫，随机挑取50条至加药组（1、10、50

养，每天同一时间将线虫转移至新的同浓度培养皿

内，并观察线虫的存活情况。线虫死亡及剔除标

准：无运动迹象，用铂丝轻触后10s无反应；线虫

因爬出培养皿失踪或贴壁致死的不计入数据。实

验重复3次，整理数据并绘制曲线。使用Graphpad

软件进行统计分析，并计算Kaplan–Meier寿命和P

值。实验重复3次，整理数据并作图。

1.4

将同期化的野生型N2线虫随机挑取50条至

抗应激实验

1条至加药组与空白对照组，每组10个培养皿，此

基中，每天记录虫卵数目（产卵量），连续记录4d计

算总产卵量。实验重复3次，整理数据并作图。

1.7衰老相关基因测定

时记为产卵第1天，每隔24h将线虫挑至新培养

使用定量实时PCR确定抗衰老相关基因的表

达。将同期化线虫分别在空白和含有不同浓度阿

魏酸的NGM培养基中培养5d后，采用TRIzol从大

约1000条线虫中提取总RNA，并采用定量RT试

剂盒提取cDNA。使用实时荧光定量PCR检测系

统，使用SYBRgreen对实时荧光定量PCR进行评

估。引物如表1所示，act-1作为参考基因，使用

2-

ΔΔ

Ct法分析比较基因表达水平。

加药组（1、10、50mg/mLFA）与对照组，预先培养6

d后进行应激实验。在热冲击实验中，线虫暴露于

37℃培养箱中进行应激，每小时统计一次寿命，直

到所有线虫死亡为止。实验重复3次，整理数据并

作图。氧化应激实验与抗热应激实验的线虫培养

方法相同，将同期化的野生型N2线虫随机挑取50

表1

Table1

Genes

Act-1

Daf-2

Akt-2

Daf-16

Sod-3

Clk-1

Ctl-2

Age-1

线虫抗衰老相关基因实时定量PCR引物

ReversePrimer5’-3’

saging-relatedgenes

Forwardprimer5’-3’

CATCCCAGTTGGTGACGATATCGGTATGGGACAGAAGGAC

TGAAAGCGAAGCAGCGAGAAGG

CACCACAATACGCCCCACACTC

CGGGAGAGAGGGACACGCTTC

GGCTAAGGATGGTGGAGAAC

GCACATACTGCTGCTTCTCG

ACACGGACACGCATTACCA

CGTCCGAACTTCCGCATCACTC

AGGACCTCGCGCCACTATAGC

ACAGGTGGCGATCTTCAAG

TTCCTCCAAACAGCCACC

ACGGAATTGCTCAGCCACCATG

TCATTCCATCGTGTTCTACTCC

GGCTGCTCAATCGCCAACTCCCGCCACGGCAACATCCTCAG

196

中山大学学报（医学科学版）

第42卷

1.8

本实验采用

DAF-16::GFP

TJ356

核易位测定

突变体线虫，该品系线虫特

异性标记了

TJ356

DAF-16：：GFP（zls356）。将同步化的

L）固定在

突变体用

2％琼脂糖垫中，

FA处理6d

然后在荧光显微镜下观

，然后用NaN

（

3

20?mol/

10×

察（

）

激发波长：

。将DAF-16

460~495

：：GFP

nm

的表达模式评估为

；发射波长：510~550

“胞质

nm，

定位”和“核定位”，并计算DAF-16蛋白定位在每

个治疗组中的百分比。

1.9

使用

数据处理

SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料用

均数

way

±

ples

ANOVA

标准差表示。通过单因素方差分析

0.05

ttest）对观察到的差异进行统计学检验，

）和独立样本t检验（independent-sam?

（one-

P

独立重复

（双侧）

3次。

为差异具有统计学意义。所有实验均

<

2结果

2.1

使用不同浓度的阿魏酸

阿魏酸对线虫寿命的影响

50

（500?mol/L）和1

虫寿命的影响示于图

、100mmol/L对野生型

、10、

1和表

N2线虫进行处理后，

2。在给予500?mol/L

对线

和1、10、50、100mmol/L阿魏酸后，秀丽隐杆线虫寿

命明显延长（P＜0.05），且呈浓度依赖趋势，但阿魏

酸在1~50mmol/L范围内延寿效果最为明显，故本

研究选取1、10和50mmol/L浓度梯度进行实验。

与对照组相比，给予阿魏酸后线虫的平均寿命由

0.11

12.89±0.2

12.41

）

较，经单因素方差分析，

％、

、（17.01±0.13

）d分别增加至（14.49±0.21）、（15.41±

19.55％、31.96

）d，

％。对

线虫的

4组间差异具有统计学意

4组线虫寿命检测比

寿命分别延长了

义（F=271.482，P＜0.001）；采用LSD-t检验进一步

作两两比较，

10

我们发现与对照组相比，阿魏酸（1、

加

2.2

（

、50

P＜

mmol/L

0.001、

）

P

处理后的秀丽隐杆线虫寿命明显增

＜0.001和P＜0.001；表2，图1）。

将秀丽隐杆线虫暴露于热应激和氧化应激环

阿魏酸对线虫抵抗应激能力的影响

境下，比较处理组与对照组对寿命的影响。经过热

应激处理后（图2A），对照组中线虫的平均存活时

间为（6.81±0.13）h，而50mmol/L阿魏酸处理组的

线虫的平均存活时间可延长至（8.35±0.43）h。4组

线虫寿命检测比较，经单因素方差分析，4组间差

tions

A：Effectofferulicacidonlifespaninawiderangeofconcentra?

trations

；B

trolbyLSD-test

；

：

1

Effects

）means

of

after

P

ferulic

＜

图1

ANOVA.

0.05

acid

vs.

on

control

lifespan

；2）

in

means

asmall

P

range

＜0.001

ofconcen?

?

秀丽隐杆线虫寿命曲线

s

表2阿魏酸对线虫寿命的影响

s

Groups

Starting

numbernumber

ValidMeanlifes?

Control

FA

FA

（1

480

480

467

480

470

12.89±0.2

pan/days

14.49±0.21

1）

FA

（

mmol/L）

（

10

50

mmol/L）

480

462

464

15.41±0.11

1）

F

mmol/L）17.01±0.13

1）

P

＜

271.482

0.001

1）

P

异具有统计学意义（F=9.825，P＝0.005）；采用

LSD-

魏酸在

t检验进一步作两两比较，

10mmol/L和50mmol/L时抗热应激力明显

与对照组相比，阿

增加（P=0.019，P=0.001）。接下来，我们采用双氧

水急性应激实验来测试阿魏酸的抗氧化能力（图

2B

4.16±0.16

）。结果显示，

）h最高延长到

阿魏酸处理组可将线虫的寿命从

（5.14±0.24）h。同样，我

们使用单因素方差分析对4个不同浓度组进行寿

（

（

第2期

况琪斐，等.阿魏酸通过胰岛素/IGF信号通路和DAF-16促进秀丽隐杆线虫寿命和应激抵抗力

197

命比较，与对照组相比，4组间差异具有统计学意

义（F=6.571，P＝0.015）；采用LSD-t检验进一步作

两两比较，与对照组相比，阿魏酸在1mmol/L时抗

应激能力没有明显差异（P＞0.05），但在10mmol/L

和50mmol/L时抗氧化应激力明显增加（P=0.016，P

=0.003）。

2.3阿魏酸对线虫体长和脂褐素的影响

Groups

表3

Table3

阿魏酸对线虫应激抵抗的影响

Thestressresistanceofferulic

s

Meanlifes?Meanlifes?

panafter

Thermal

shock/h

oxidative

stress/h

4.16±0.16

4.68±0.33

panafterStarting

numbernumber

150

150

150

150

150

150

150

150

Valid

接下来，我们比较了不同处理组中线虫的体

Control

FA（1mmol/L）

6.81±0.13

7.29±0.13

FA（10mmol/L）

F

P

1）

FA（50mmol/L）

7.68±0.55

1）

4.85±0.34

2）

8.35±0.43

3）

5.14±0.24

4）

9.825

0.005

6.571

0.015

P=l；

2）

P=l；

3）

P=0.001vs.

4）

control；

P=lbyLSD-testafterANOVA.

型。经过单因素方差分析，比较四组的虫体长度，

结果表明虫体长度间无统计学差异（F=0.101，P＞

累情况。比较四组的脂褐素积累情况，经单因素方

shock；B：Effectsofferulicacidonsurvivalofnematodesunderoxida?

tivestress；1）meansP＜lbyLSD-testafterANOVA.

A：Effectofferulicacidonthesurvivalofnematodesat37°Cthermal

0.05；图3）。接着我们继续测量了线虫的脂褐素积

差分析，四组间的脂褐素积累差异具有统计学意义

（F=20.752，P＜0.001；图4）。采用LSD-t检验进一

步作两两比较，10mmol/L和50mmol/L阿魏酸组线

虫的脂褐素含量比对照组分别降低了13.3％、

28.3％（P=0.008、P＜0.001）。

图2阿魏酸对应激抵抗的影响

s

A：control；B：FA（1mmol/L）；C：FA（10mmol/L）；D：FA（50mmol/L）；E：Ferulicacidhadnosignificanteffectonthebodylength.

图3阿魏酸对线虫体长的影响

s

2.4

为证实该药物是否会对线虫产生副作用，我们

阿魏酸对线虫繁殖力的影响

总数上差异无统计学意义（P＞0.05；图5）。这些结

果表明阿魏酸对线虫的繁殖力没有明显副作用。

2.5

综合图1~5的结果，阿魏酸可延长线虫衰老，

衰老相关基因的表达

进行了繁殖力测定。结果表明，与对照组相比，在

分别补充1、10、50mmol/L阿魏酸后的线虫在子代

198

中山大学学报（医学科学版）

第42卷

1）2）

P=l；P＜lbyLSD-testafterANOVA.

A：control；B：FA（1mmol/L）；C：FA（10mmol/L）；D：FA（50mmol/L）；E：Relativelipofuscinaccumulation，n=3/group，F=20.75，P＜0.001.

图4

Fig.4

阿魏酸对线虫脂褐素的影响

s

mmol/L）；Differentconcentrationsofferulicacidhadnosignificantef?

scomparedwiththecontrolgroup.n=

3/group,F=0.345，P=0.794afterANOVA.

A：control；B：FA（1mmol/L）；C：FA（10mmol/L）；D：FA（50

n=3/group.

1）

t=32.73,P＜l;

2）

t=7.02,P=0.002vs.

control;

3）

t=3.21,P=l;

4）

t=7.046,P=lby

independentt-test.

图5阿魏酸对线虫繁殖力的影响

s

图6阿魏酸对衰老相关基因表达的影响

Effectsofferulicacidonexpression

ofsenescencerelatedgenes

Fig.5Effectsofferulicacidonthetotalbreedingpopula?

Fig.6

并且在50mmol/L时效果最佳，但是影响这些作用

的机制尚不清楚。因此，我们选择了此浓度用于后

续的研究。首先，我们确定了与寿命相关的基因的

表达水平。结果表明，阿魏酸可以明显影响age-1

、

daf-2

、

akt-2

、

daf-16的表达（图6）。对照组的基因

表达定义为1。与对照组相比，在阿魏酸处理后，

线虫体内的age-1

，

daf-2

，

akt-2的基因表达量分别

下调至0.79±0.04

、

0.65±0.16

、

0.59±0.32（P＜0.001

、

P=0.002

、

P=0.033）。同时，daf-16mRNA的相对表

达量较空白组相比升高至1.44±0.11（P=0.002）。

（

CF1038

）秀丽隐杆线虫寿命的影响

2.6阿魏酸对

daf-2

（

DR1572

）和

daf-16

A：Ferulicacidhadnosignificanteffectonthelifespanofdaf-2mutant

nematode（DR1572）；B：Ferulicacidhadnosignificanteffectonthe

lifespanofdaf-16mutantnematode（CF1038）.

daf-2和daf-16基因通过胰岛素信号通路

（IIS）调控线虫的应激抗性和寿命。我们确定了阿

魏酸是否能影响daf-2（DR1572）的突变体daf-16

（CF1038）秀丽隐杆线虫的寿命（图7，表4）。阿魏

酸处理后，daf-2（DR1572）突变体的平均寿命没有

明显增加（P＞0.05），daf-16（CF1038）秀丽隐杆线

虫的平均寿命也未见明显延长（P＞0.05）。

图7阿魏酸对突变体线虫寿命的影响

ofmutantNematodes

Fig.7Effectofferulicacidonthelifespan

2.7

daf-16是胰岛素信号通路中主要的转录因子，

DAF-16核定位

第2期

表4

况琪斐，等.阿魏酸通过胰岛素/IGF信号通路和DAF-16促进秀丽隐杆线虫寿命和应激抵抗力

阿魏酸对daf-2（DR1572）突变体和daf-16

（CF1038）秀丽隐杆线虫寿命的影响

EffectofREonthelifespanofdaf-2

elegans

StartingValid

Meanlifespan/days

daf-2

199

比，加药组的野生型N2菌株中，sod-3和ctl-2的相

对表达水平上调至1.69±0.33和1.38±0.12（P=

0.021，P=0.005；图9A），并且dod17和clk-1相对表

达水平分别下调至0.46±0.07和0.74±0.18（P＜

（CF1038）秀丽隐杆线虫中的基因表达（图9B），发

Table4

（DR1572）mutantsanddaf-16（CF1038）mutantsC.

0.001，P=0.002；图9A）。然而，通过比较daf-16

现50mmol/L阿魏酸处理组与对照组相比，sod-3，

ctl-2，dod17和clk-1的mRNA表达没有明显差异（P

＞0.05；图9B）。

Groups

Control

t

numbernumber

（DR1572）（CF1038）

150

150

150

150

19.38±0.6213.39±1.27

19.35±0.8213.57±1.31

0.045

0.966

0.174

0.870

mutantsmutants

daf-16

FA（50mmol/L）

P

3讨论

衰老过程中伴随着人体免疫功能的下降，生理

groupwerecomparedwithindependentt-test.

ThemeanlifespanbetweenthecontrolgroupandFA-treated

完整性逐渐丧失，导致功能受损并加剧了许多慢性

疾病

［15］

。尽管老化是不可逆的过程，但老化速度可

以延迟

［16］

。饮食干预是一种抗衰老和改善健康的

可调节秀丽隐杆线虫的寿命和应激抵抗性，DAF-

16的核定位对于下游基因的激活至关重要。因

易位并确定了阿魏酸对DAF-16核定位的影响（图

被50mmol/L阿魏酸处理后DAF-16：：GFP在细胞

（P＜0.001）。

2.8

此，我们利用转基因菌株DAF-16：：GFP观察其核

8）。GFP信号分为胞质定位或核定位。结果表明，

核定位的线虫比例从（5.3±1.5）％增加到（28±3）％

阿魏酸对daf-16下游基因表达的影响

有效非遗传方法。马齿苋可以通过胰岛素/IGF-1

样信号通路来提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶

的活性，并且降低活性氧和丙二醛的含量从而增强

秀丽隐杆线虫的抗逆性并延长寿命

［17］

。忍冬提取

物的3种主要化合物（绿原酸、1，5-二咖啡酰奎尼

酸和1，3-二咖啡酰奎尼酸）的组合可显著延迟由

蓝莓提取物可以通过在胰岛素/IGF信号传导途径

应激抵抗能力

［19］

。

阿魏酸是一种常见的多酚化合物，多见于蔬

菜，尤其是洋蓟、茄子（约占总多酚的90％）和玉米

［20］

糠（约占总多酚的3.1％）。同时，它也是一种含

Aβ毒性引起CL4176品系秀丽隐杆线虫的麻痹

［18］

。

和DAF-16延长线虫寿命，改善健康指标并且增强

以上结果表明，突变体的寿命与DAF-16的调

控密切相关，转录因子DAF-16可以调控下游基

因，延长线虫的寿命。因此，我们确定了daf-16下

游基因的表达水平（sod-3，ctl-2，dod17和clk-1；图

9A）。对照组的基因表达定义为1。与对照组相

有多种生物活性的植物化学单体，先前已有研究

［21］

0.001.

1）

P＜lbyLSD-testafterANOVA.

A：control；B：FA（50mmol/L）；C：positivecontrol；Scalebar=100?m.D：Daf-16nucleartranslocationhistogram.n=3/group，F=1940.235，P＜

图8阿魏酸对DAF-16核转位的影响

Fig.8EffectsofferulicacidonnucleartranslocationofDAF-16

200

中山大学学报（医学科学版）

第42卷

nematodes.

A：Effects

n

of

=3/group.

ferulicacid

1）

t=5.47

on

，

the

P=0.005

downstream

l

gene

；

of

2）

t=7.15

DAF-16

，P=0.002

inN2

l；

3）

t=3.67，P=l；

4）

t=11.62，P＜?

trol

downstream

byindependentt-test.B：Ferulicacid

图

gene

9

of

阿魏酸对

DAF-16in

DAF-16

daf-16（CF1038

hadno

下游基因的影响

）

significant

mutantsnematodes.

effectonthe

Fig.9Effectsofferulicacidonthe

downstreamgenesofDAF-16

表明阿魏酸在体外具有抗氧化性、抗炎活性以及有

助于抵抗神经退行性病变，它被认为在预防各类疾

病和促进健康方面效果显著。然而，阿魏酸的抗衰

老活性及其作用机制尚未见报道。在当前的研究

中，我们采用秀丽隐杆线虫作为模式动物，系统的

探究了阿魏酸对线虫衰老的影响。同空白对照组

相比，阿魏酸能够显著延长野生型线虫N2的寿

命。随着秀丽隐杆线虫的衰老，它们对外部刺激的

抵抗力急剧下降，内源性ROS的增加进一步加速了

衰老过程，形成了恶性循环。于是我们测试了线虫

的抗应激能力，结果发现阿魏酸可明显提高线虫在

抗氧化应激和抗热应激环境下的寿命，降低来自过

氧化氢和热应激所诱导的氧化损伤和热冲击。体

长和脂褐素都是评估线虫健康状况的常用指标。

寿命的增加通常伴随着其他生理指标的降低。我

们发现阿魏酸能够明显减少脂褐素在线虫中的沉

积并且不影响体型的变化。上述实验证明，阿魏酸

可以有效延长线虫的寿命，提高对环境的应激能

力，并降低线虫脂褐素的积累水平，而对线虫的体

长没有显著影响。但是，一些研究人员观察到寿命

的延长可能与生殖力的下降有关。因此，我们进行

了繁殖力测定以阐明阿魏酸是否对线虫有副作用。

结果显示，阿魏酸对线虫的繁殖力没有明显的副作

用。阿魏酸可能不会影响种系信号导致的生殖细

胞的生育变化，例如精子发生和卵子生成，也不会

影响其生长速率

［22］

。同时不影响线虫的产卵量和

体型，体现出抗衰老作用。胰岛素/IGF-1信号传导

IIS）途径是调节秀丽隐杆线虫衰老的主要途径，

该途径从DAF-2胰岛素受体通过AGE-1/PI3K到

AKT-1/2

线虫的寿命和相关代谢

，再到DAF16/FOXO

［23］

。为探究阿魏酸延长秀

转录因子，从而控制

丽隐杆线虫是否涉及此条通路，我们首先测定了通

路中几个主要基因的表达。本实验结果表明，在阿

魏酸处理后，age-1

、

daf-2和akt-2基因的mRNA相

对表达水平分别下调，且daf-16基因的mRNA相对

表达水平上调（P=0.002）。此外，通过对通路上两

种基因突变体线虫daf-2（DR1572）和daf-16

CF1038）的进一步研究，发现阿魏酸处理组与对

照组的突变体线虫的寿命之间没有显著差异性，线

虫在缺失daf-2和daf-16基因后，阿魏酸的延寿效

果消失。以上结果表明，阿魏酸可能通过胰岛素

daf-2/daf-16

号通路调控应激抵抗和长寿的关键因子，

延长线虫寿命。DAF-16是胰岛素信

它主要分

布在细胞质中，当被磷酸化并激活时，会导致其在

细胞核中积累，从而激活其功能以调节下游靶基

因，例如sod-3

、

ctl-2

、

clk-1和dod-17，这几个基因

在新陈代谢、氧化应激和衰老中起着重要作用

［24］

。

我们的进一步研究发现，经过阿魏酸处理后，促进

了DAF-16的核定位，并上调其下游基因sod-3

、

ctl-

2基因的mRNA表达，同时下调dod-17和clk-1基因

的mRNA表达水平。Song等

［25］

研究发现，激活daf-

16基因可促进其核定位以及调节下游靶基因的表

达，提高应激抵抗力并延长寿命与本实验结果相似。

综上所述，阿魏酸可通过胰岛素/IGF-1信号通

路和DAF-16增强线虫的抗应激能力，延长线虫寿

命，改善健康水平。本研究结果为阿魏酸的研究和

开发进一步提供了有力的理论基础，但寿命调控机

制错综复杂，有待于继续深入探究。

（

（

第2期

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