利用饲养细胞体外扩增高纯度的效应NK细胞

2024年3月23日发(作者：海马323改装)

利用饲养细胞体外扩增高纯度的效应NK细胞

郭振兴;张艳慧;刘绍辉

【摘 要】目的 比较两类饲养细胞(FC)体外扩增自然杀伤(NK)细胞的效果,鉴定出特

定的NK细胞群并进行功能性分析,从而确定最优的FC.方法 构建两类FC,分别是第

1代FC(FC-000,K562-41BBL)和第2代FC(FC-002,K562-41BBL-mbIL15-

mbIL21),分别与人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear

cells,PBMCs)共培养14d,收获细胞,流式细胞术鉴定NK细胞表型,利用实时无标记

细胞分析仪检测两类NK细胞对A549肿瘤细胞的杀伤能力.结果 培养14d后,FC-

002扩增的NK细胞纯度(93.5％)高于FC-000扩增的NK细胞(70.2％)(P＜

0.05);FC-002扩增的NK细胞增殖倍数(3 325)高于FC-000扩增的NK细胞增殖

倍数(10)(P＜0.05).两者均促进了具有NKG2D、NKp44、CD69功能性受体的NK

细胞群增殖,且FC-002扩增的NK细胞具有更高的肿瘤杀伤能力及干扰素-γ表达

能力(P＜0.05).结论 利用FC能够在体外有效地扩增高纯度的NK细胞,并能够选择

性扩增具有NKG2D、NKp44、CD69功能性受体的NK细胞群,且第2代FC所扩

增的NK细胞对于肿瘤细胞具有更强的杀伤能力,并在NK细胞增殖倍数、纯度上

均优于第1代FC.

【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》

【年(卷),期】2019(040)002

【总页数】6页(P174-179)

【关键词】自然杀伤细胞;体外扩增;饲养细胞;体外杀伤

【作 者】郭振兴;张艳慧;刘绍辉

【作者单位】同济大学医学院,上海200092;山东省千佛山医院儿科,济南250014;

同济大学医学院,上海200092

【正文语种】中 文

【中图分类】R392.12

自然杀伤(nature killer, NK)细胞是一类大颗粒淋巴细胞，表型为CD3-CD56+，

发源于骨髓，主要分布于外周血、肝脏和脾脏[1-2]。在功能上，NK细胞介于固有

免疫和适应性免疫之间，具有一定的记忆性[3-6]。然而NK细胞仅占人体外周血

细胞的5%～15%，且大多数处于未激活状态。NK细胞的体外扩增技术仍不成熟，

限制了NK细胞临床应用的普及[7-8]。

本方案采用饲养细胞(FC)来扩增外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear

cells, PBMCs)中的NK细胞，通过FC胞膜表面所表达的表面分子与目的细胞的相

互作用，选择性地刺激目的细胞的增殖。Phan等[9]利用构建的GE_K562细胞

(K562-mbIL15-41BBL)共培养人PBMC 21d后，NK细胞增殖达到977倍左右

[10]。本研究在此基础上构建了两类FC，即第1代FC(FC-000，K562-41BBL)及

第2代FC(FC-002，K562-41BBL-mbIL15-mbIL21)。两者的主要区别是是否带

有膜结合型的IL-15及IL-21，这两类细胞因子均具有促进NK细胞增殖的作用。

本研究通过比较两类FC对NK细胞增殖的影响并通过NK细胞群的表型鉴定、功

能作用的验证来确定最优FC，以优化NK细胞的扩增技术。

1 材料与方法

1.1 试剂及细胞

人非小细胞肺癌细胞系A549于美国模式培养物集存库获得；FC是通过慢病毒转

导K562细胞系所构建而来，即第1代FC(FC-000，K562-41BBL)及第2代

FC(FC-002，K562-41BBL-mbIL15-mbIL21)；重组人白细胞介素2(rhIL-2)购自

PeproTech公司；RPMI 1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公

司；磷酸盐缓冲液(PBS)和青/链霉素购自Hyclone公司；庆大霉素购自上海中西

制药有限公司；淋巴细胞分离液购自CEDARLANE公司；吖啶橙/碘化丙啶

(AO/PI)购自Nexcelom Bioscience公司；流式抗体均购于BD公司。

1.2 样本及细胞培养方法

人PBMCs样本来源于健康供体的新鲜外周血，将3mL外周血加入等体积的杜氏

磷酸缓冲液(DPBS)稀释后再与Lympholyte?-H按2∶1的体积进行密度梯度离

心分选，室温离心(800×g,20min)，收集PBMC层并用DPBS进行稀释，再次离

心(800×g,10min)，将细胞洗2～3次，然后用RPMI 1640培养液重悬。分离后

的PBMC可用添加了10%胎牛血清(FBS)、10%DMSO的RPMI 1640培养液冻

存液重悬，分装后置于液氮罐中冷冻保存待用。

人非小细胞肺癌细胞系A549用含有10%FBS、100mg/L青霉素、100U/mL链

霉素的DMEM培养基培养；FC用10%FBS、1%青/链霉素的RPMI 1640培养基

培养，收获细胞于辐照仪中100Gy辐照；FC、PBMC的共培养体系则是用含有

300U/mL的rhIL-2、10U/mL庆大霉素、10%FBS的RPMI 1640培养基培养。

以上细胞培养体系均置于含5%CO2、37℃的恒温培养箱里。

在实验当天时，将供体PBMC以及辐照的两类FC密度调整到1×106/mL后，分

别按照1∶1的FC∶PBMC比例混合进行共培养。7d时，再次按照1∶1比例添加

FC，每1～2d进行换液或补液；14d时，收获细胞，统计并进行表型分析及杀伤

实验。设置不加FC的单独PBMC组作为对照。

1.3 NK细胞表型及纯度鉴定

分别在0、14d收集共培养体系中的细胞并调整至2×105/mL，将细胞分为3组，

分别以标记anti-CD3、anti-CD56、anti-NKG2A、anti-NKG2C、anti-NKG2D、

anti-CD94、anti-NKp30、anti-NKp44、anti-NKp46、anti-CD158a、anti-

CD158b、anti-CD158e1、anti-CD69、anti-DNAM-1、anti-2B4抗体作为实

验组；以标记IgG1-APC、IgG1-PE、IgG2b-PE、IgM-FITC、IgG2b-BV650、

IgG1-BV786、IgG1-BV421、IgG1-BV510组作为同型对照组；未加抗体组为阴

性对照。4℃避光孵育30min后用含2%FBS的PBS洗2遍，重悬后上流式细胞

仪进行检测，利用FlowJo软件进行数据的处理。培养体系中CD3-CD56+细胞的

占比即为NK细胞的纯度。

1.4 NK细胞的杀伤实验

杀伤实验利用艾森生物的实时无标记细胞分析仪(RTCA)进行，该细胞分析仪通过

嵌在E-plate板上孔底的微电子感应器阻抗变化去感受细胞的有无以及贴壁、黏附

和生长程度的改变，可实时、直观地反映细胞增殖、存活、凋亡、形态变化等细胞

生物学变化情况。13d时，收集A549细胞并调整密度为1×105/mL，然后向

RTCA专用96孔板每孔加入100μL A549细胞悬液进行铺板；14d时，收获共培

养体系中的细胞并用含rhIL-2的DMEM培养基调整细胞密度为2×105/mL，然

后分别按照效靶比E∶T为5∶1、1∶1、0.2∶1的比例添加NK细胞，杀伤体系终

体积200μL(含300U/mL rhIL-2、10%FBS、100mg/L青霉素、100U/mL链霉

素的DMEM)，设置未加NK细胞的A549组作为对照组；所有组均设置复孔。加

入NK细胞2h后，计算杀伤效率，所得实验数据(细胞指数、杀伤时间等)采用

RTCA Software 2.0软件进行处理。杀伤72h后，收集杀伤体系上清液，利用流

式检测干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平，分析其平均荧光强度(mean fludrescence

intensity, MFI),MFI值的高低代表着NK细胞分泌IFN-γ的能力强弱。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件包对实验数据进行统计处理，所得数据用表示，组间差异比

较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FC-002及FC-000体外扩增NK细胞倍数及纯度

FC-000表达细胞共刺激配体41BBL，但不表达mbIL21和mbIL15，见图1A；

FC-002同时表达41BBL、mbIL21、mbIL15，见图1B，证明此批FC构建成功。

与对照组相比，两类FC均能刺激NK细胞的扩增。但FC-002对NK细胞的扩增

倍数(3325倍)优于FC-000(10倍)(P<0.05)，见图1C。且FC-002扩增的NK细

胞纯度(93.5%)也高于FC-000所扩增的NK细胞纯度(70.2%)(P<0.05)，见图1D。

表明FC-002体外扩增NK细胞效果优于FC-000。

图1 FC表型及共培养14d后NK细胞的扩增倍数及纯度Fig.1 The expansion

fold and purity of NK cells in co-culture systemA： FC-000表型;B： FC-002

表型;C： 共培养14d的NK细胞扩增倍数；D： 共培养14d的NK细胞纯度

2.2 FC-002促进具有特定功能性受体的NK细胞群增殖

与对照组相比，两类FC与PBMCs共培养14d后，FC-000刺激扩增的NK细胞

的NKG2D、NKp44、CD69、CD158a分别上升30%、49%、45%、

28%(P<0.05)，FC-002刺激扩增的NK细胞的NKG2D、NKp44、CD69分别上

升43%、65%、46%(P<0.05)，CD158a则为4%(P>0.05)，见图2。

2.3 FC-002扩增的NK细胞肿瘤杀伤及IFN-γ表达能力

加入NK 2h后，与对照组相比，E∶T=5∶1时，FC-002的NK细胞杀伤效率

(95%)高于FC-000的NK细胞(33%)(P<0.05)；E∶T=1∶1时，FC-002的NK细

胞杀伤效率(45%)高于FC-000的NK细胞(13%)(P<0.05)。E∶T=0.2∶1时，FC-

002的NK细胞杀伤效率(21%)高于FC-000的NK细胞(0%)(P<0.05)(图3A、图

3B)。与此同时，FC-002扩增的NK细胞杀伤肿瘤细胞时具有更高的IFN-γ表达

能力，为FC-000的NK细胞表达能力的4倍(P<0.05)，见图3C、图3D。

图2 NK细胞功能性受体分析Fig.2 Functional receptor analysis of NK cells

图3 NK细胞对A549的杀伤能力Fig.3 Killing effect of NK cells on A549 A：

RTCA检测两种NK细胞对A549生长的影响;B： 加入NK 2h后的杀伤效率;C：

杀伤72h后上清液IFN-γ水平比较;D： IFN-γ表达的MFI

3 讨 论

NK细胞是一种大颗粒淋巴细胞，不需要预先致敏、无主要组织相容性复合体

(MHC)限制性，能够对各种外来抗原、自身突变细胞等进行非特异的杀伤，在机

体免疫系统中起重要作用[11-13]；近年，Bjorklund等[14]利用NK细胞对16例

骨髓增生异常综合征/急性髓性白血病(MDS/AML)患者进行免疫细胞治疗，其中6

例患者取得了完全缓解及部分缓解，3例在治疗后3年仍未复发，证明了NK细胞

临床治疗肿瘤的潜力。当前体外扩增NK细胞的方法主要分为2种，一种是联合

细胞因子IL-12、IL-15、IL-18等进行扩增[15-18]，Torelli等[19]利用IL-2、IL-

15共培养PBMC 2周，NK细胞增殖16倍。另一种方法是利用FC刺激NK细胞

扩增，Pahl等[20]利用构建的GE_K562细胞(K562-mbIL15-41BBL)共培养人

PBMC 21d后，NK细胞增殖达到977倍。到目前为止，采用FC进行NK细胞扩

增的方案在扩增倍数和纯度上要优于联合细胞因子的扩增方案,但仍具有很大的优

化空间。

FC主要利用慢病毒等载体将特定基因转导入某些肿瘤细胞株，使其细胞表面表达

出特定的蛋白等小分子物质，再采用X射线辐照，使得这类转导后的细胞失去增

殖能力，同时仍保留完整的细胞膜表面，FC胞膜上的功能性配体可选择性地激活

PBMC中的NK细胞，从而实现NK细胞的扩增。扩增活化效果主要与FC胞膜表

达的功能配体分子组合有关[21]。本研究构建了第1代FC(FC-000，K652-41BBL)

和第2代FC(FC-002，K562-41BBL-mbIL15-mbIL21)，两者的主要区别是是否

带有膜结合型的IL-15及IL-21，这两类细胞因子均具有促进NK细胞增殖的作用

[22]。通过实验发现FC-002能够在14d内将NK细胞扩增倍数提高到3300倍左

右，远高于FC-000，且优于Phan等[9]体外扩增NK细胞的方案。

NK细胞发挥作用依赖于细胞表面多种受体的影响，如NKG2D、NKG2A、

NKG2C、NCRs、KIRs、DNAM-1、2B4等[23-24]，这些信号综合决定了NK细

胞是否发挥作用。除此之外，两类FC均能够选择性扩增具有功能性受体NKG2D、

NKp44、CD69的NK细胞群，NKG2D和NKp44作为激活性受体，能够激活

NK细胞，使其发挥杀伤作用；CD69作为NK、T细胞的激活性标志[25-27]，表

明本方案体外扩增的NK细胞得到激活。IFN-γ是由NK细胞分泌的一种细胞因子,

其对于天然免疫与适应性免疫抵抗病毒、细菌的感染起关键作用。体外杀伤效果显

示，FC-002扩增的NK细胞在杀伤能力及IFN-γ表达能力上均优于FC-000；而

FC-000所扩增的NK细胞群带有抑制性受体CD158a的表达，FC-002对于表达

CD158a的NK细胞群则无增殖效应，提示CD158a抑制性受体的表达抑制了NK

细胞的杀伤活性，而在FC上构建膜结合型的IL-15及IL-21则不会促使表达这类

受体的NK细胞增殖。

总之，本研究方案通过对两种FC的比较，证明了第2代FC(FC-002)无论是在NK

细胞的体外扩增上，还是NK细胞纯度、NK细胞杀伤效率及IFN-γ表达能力上均

优于第1代FC(FC-000)。FC-002能够显著提高NK细胞的扩增倍数，并促进了

具有NKG2D、NKp44、CD69功能性受体的NK细胞群的扩增。NK细胞体外扩

增技术及其在肿瘤临床治疗方面的安全性、有效性和免疫生物学相关性仍需继续研

究和完善，相信NK细胞的临床应用会随之逐渐普及。

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