鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

2023年12月12日发(作者：启辰t60ev)

鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

梁红茹; 李宁求; 蔡秀珠; 范芷仪; 林强; 付小哲; 刘礼辉; 黄志斌; 牛银杰; 林蠡

【期刊名称】《《中国预防兽医学报》》

【年(卷),期】2019(041)009

【总页数】6页(P929-934)

【关键词】鳜鱼弹状病毒; N基因; TaqMan荧光定量PCR

【作 者】梁红茹; 李宁求; 蔡秀珠; 范芷仪; 林强; 付小哲; 刘礼辉; 黄志斌; 牛银杰;

林蠡

【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室 广东广州510380; 仲恺农业工程学院动物科技学院 广东广州570228

【正文语种】中 文

【中图分类】S941.6

鳜鱼(Siniperca chuatsi)是一种肉质优良的名优鱼类，味道鲜美，肉质鲜嫩、蛋白含量高，市场需求量大，经济效益较高[1]。随着鳜鱼养殖规模的扩大及养殖密度的提高，疾病的发生已成为鳜鱼养殖业主要“瓶颈”之一。其中，鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)感染引起的病毒性疾病可以导致鳜鱼大批死亡，发病严重的鱼池死亡率超过90 %[2]，该病流行广，在珠江三角洲普遍发生。鱼类感染SCRV 后典型的病状是出血性败血症，影响多种器官功能，如眼球突出变黑，腹部膨胀，皮下出血[3]。目前尚无针对该病原的有效治疗方法。

SCRV 属于弹状病毒科，为单股负链RNA 病毒，其基因组全长为11545 核苷酸，由核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖的RNA 聚合酶蛋白(L)5 个结构蛋白构成[4]。弹状病毒N 蛋白较为保守，可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3 个区域，而区域Ⅱ的氨基酸序列较为保守，是病毒复制所需的蛋白[5]。

病毒检测主要通过常规PCR 和病毒分离鉴定等常规方法[6]，但荧光定量PCR 技术具有灵敏度高、特异性好、可靠性强和实时准确等特点[7-10]。目前，针对鱼类弹状病毒的检测方法主要为普通PCR，因此本研究针对SCRV N 基因的保守区设计引物，建立 SCRV 的 TaqMan 荧光定量 PCR 检测方法，为SCRV 的定性和定量检测、该病防控提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 病毒与样品 SCRV、 草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病病毒(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)均由中国水产科学研究院珠江水产研究所保存。35 份临床样品为2018年8 月～2018年10 月采集自广东佛山、东莞等地养殖鱼塘疑似发病鱼的肾、脾、肝、脑等组织。

1.2 主要试剂 2×Easy Taq Super Mix (TRANS)、大肠杆菌DH5α 感受态细胞、TRIzol 试剂购、RNA提取试剂盒均购自全式金生物技术公司；Premix Ex TaqTM

(Probe qPCR)、 ROX Reference Dye Ⅱ 、EasyScript One-Step gDNA

Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TRANS)反转录试剂盒均购自TaKaRa公司；DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物设计 根据GenBank 中SCRV N 基因序列(NC008514.1)，应用Primer5

软件设计特异性引物和探针，第一对引物(SCRV-N-F/SCRV-N-R)扩增SCRV N

基因的ORF 框，扩增产物长度为1 290 bp，用于构建重组质粒标准品；第二对引物(Rhabdovirus140-F/Rhabdovirus140-R)和探针(Rhabdovirus140 TAP)用于荧光定量PCR 扩增，扩增产物长度为140 bp。引物和探针由广州擎科生物科技有限公司合成。引物和探针序列为：

SCRV-N-F：5\'-ATGGAAAACCAAATCATCAAGAG-3\'/SCRV-N-R： 5\'-TCACAAAGCTTGGTGTTTCAGC-3\'；Rhabdovirus140-F：5\'-GACATGTTCTTCTACAGATTC AAC-3\'/Rhabdovirus140-R：5\'-CAATCCAGCACTCCA CTG-3\'；Rhabdovirus140 TAP：5\'-AGGTTCAAAGAC

TGTGCAGCTCTGT-3\'。

1.4 重组质粒标准品的制备 利用TRIzol 法提取SCRV 病毒总 RNA，反转录获得

cDNA 为模板，SCRV-N-F/SCRV-N-R 为引物进行PCR 扩增。反应条件为 94 ℃

5 min，94 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃1 min，共35 个循环；72 ℃ 8 min。同时以灭菌水为模板作为阴性对照。PCR 产物经胶回收试剂盒纯化回收后连接pMD19-T 载体构建重组质粒，转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞扩增培养后提取重组质粒，经PCR 和测序鉴定阳性重组质粒作为质粒标准品，利用微量分光光度计测定重组质粒的浓度。根据公式拷贝数 /μL=(ng/μL×10-9)×(6.02×1023)/DNA length×660)将其换算成相应的拷贝数。

1.5 荧光定量PCR 的条件优化 采用TaqMan 探针技术，参照Premix Ex TaqTM

(Probe qPCR)说明书建立20 μL 反应体系，采用矩阵法对引物(0.2 μmol/L、0.4

μmol/L、0.5 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L)和探针浓度(0.2

μmol/L、0.4 μmol/L、0.5 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L)进行优化，初步建立荧光定量PCR 检测方法。

利用EASY Dilution 将重组质粒标准品配制后10 倍倍比稀释(1×108 拷贝 /μL～1×101 拷贝 /μL)，分别以其为模板，以灭菌的ddH2O 为阴性对照，采用建立的TaqMan 荧光定量PCR 进行检测，反应结束后收集数据，绘制标准曲线。 1.6 特异性试验 利用DNA 提取试剂盒提取ISKNV、KHV、SGIV 等DNA，利用RNA 提取试剂盒提取 SCRV、 GCRV、 TiLV、 NNV、 SVCV 等RNA 后反转为cDNA 备用。分别以质粒标准品、ISKNV、 KHV、 SGIV 提 取 的 DNA 和 SCRV、GCRV、TiLV、NNV、SVCV 的 cDNA 为模板，利用本研究建立的SCRV

TaqMan 荧光定量PCR 方法进行检测，设灭菌ddH2O 为阴性对照，评估该方法的特异性。

1.7 敏感性试验 将重组质粒标准品10 倍倍比稀释(1×108 拷贝 /μL～1×101 拷贝

/μL)，分别以其为模板，以灭菌ddH2O 为阴性对照，分别利用本研究建立的TaqMan 荧光定量PCR 和1.4 中常规 PCR 方法进行检测，以评估该方法的敏感性。

1.8 重复性试验 选取 1×108 拷贝 /μL、1×106 拷贝 /μL、1×104 拷贝 /μL 这 3

个浓度的质粒标准品作为模板，每个浓度重复3 次，进行组内重复性试验；将上述3 个浓度的质粒标准品均设3 个重复，每间隔3 d 检测1 次，连续检测3 次，进行组间重复性试验。根据Ct 值计算组内和组间变异系数，评价该方法的重复性。

1.9 临床样品的检测 按常规方法对收集的35 份临床样品处理后，利用DNA/RNA

共提取试剂盒操作步骤提取样品RNA 反转录获得cDNA，同时利用本研究建立的TaqMan 荧光定量PCR 方法和1.4 中常规PCR 方法对35 份临床样品核酸进行检测，比较二者检测结果。

2 结 果

2.1 重组质粒标准品的制备与鉴定结果 以提取的SCRV 的cDNA 为模板PCR 扩增后结果显示，目的条带约为1 300 bp (图1)，与预期相符。目的片段回收纯化后克隆至载体pMD19-T 中，构建的重组质粒标准品，经PCR 和测序鉴定，结果显示目的片段与预期插入片段相同，表明重组质粒标准品正确构建。经检测计算质粒标准品浓度为159 ng/μL。经计算质粒标准品拷贝数为1.12×1011 拷贝/μL。 图1 重组质粒的PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification result of recombinant

plasmid

2.2 荧光定量PCR 的条件优化及标准曲线的建立 采用矩阵法优化后，20 μL 反应体系为：Premix Ex-TaqTM 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.5 μL，上下游引物各 0.6 μL，探针 0.6 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 6.7 μL，总体系为 20

μL。PCR 扩增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共 40 个循环。

以10 倍倍比稀释的质粒标准品作为模板，按照优化后的反应体系进行TaqMan

荧光定量PCR 扩增，根据结果获得标准曲线(图2)，结果显示标准方程为Y=-3.163x+45.216，相关系数为0.999，荧光定量 PCR 在 1×108 拷贝 /μL～1×101 拷贝 /μL 范围内有较好的线性关系。

图2 SCRV 实时荧光定量PCR 标准曲线图Fig.2 Standard curve of real-time

PCR assay for the detection of SCRV plamid

2.3 特异性试验结果 利用建立的TaqMan 荧光定量PCR 方法分别对质粒标准品、ISKNV、SCRV、GCRV、KHV、SGIV、TiLV、NNV、 SVCV 进行检测，结果显示，除质粒标准品和SCRV 检测结果为阳性外，其它样品均为阴性(图3)，表明本研究建立的TaqMan 荧光定量PCR 方法具有较强的特异性。

图3 SCRV TaqMan real-time PCR 特异性检测结果Fig.3 Specificity assay of

the real-time PCR

2.4 敏感性试验结果 对质粒标准品按照10 倍倍比稀释，分别采用常规PCR 和TaqMan 荧光定量PCR 方法进行检测，结果显示，TaqMan 荧光定量PCR 方法最低检测浓度为 102 拷贝 /μL，常规 PCR方法最低检测浓度 1.0×104 拷贝 /μL

(图 4)。二者阴性对照均无扩增，TaqMan 荧光定量PCR 的敏感性是常规PCR 的100 倍。表明本研究建立的TaqMan荧光定量PCR 方法敏感性较高。

2.5 重复性试验结果 选取3 个不同浓度的质粒标准品进行组内和组间重复试验，结果显示，组内和组间变异系数均小于2 % (表1)，表明建立的Taq-Man 荧光定量PCR 方法具有良好的重复性。

图4 SCRV 荧光定量PCR(A)和常规PCR(B)敏感性检测结果Fig.4 Sensitivity

analysis of the SCRV real-time PCR (A)and the conventional PCR (B)

表1 SCRV 荧光定量PCR 的重复性试验结果Table 1 Reproducibility assay of

the SCRV TaqMan real-time PCR质粒浓度Concentration of plasmid

standard(copies/μL)108 106 104 n 3 3 3组内变异试验Intra-assay variability

(Ct)组间变异试验Inter-assay variability (Ct)平均数X±SD 19.53±0.31

26.37±0.26 33.46±0.30变异系数CV (%)1.580 0.986 0.897平均数X±SD

19.97±0.11 26.61±0.16 33.26±0.10变异系数CV (%)0.551 0.601 0.301

2.6 临床样品检测 利用建立的SCRV TaqMan 荧光定量PCR 方法对35 份临床样品进行检测，荧光定量PCR 检测结果显示阳性样品11 份，检出率为31 %，常规PCR 检测结果显示阳性样品为5 份，检出率仅为14 %。表明建立的TaqMan 荧光定量PCR方法可用于临床样品中SCRV 的检测，且比常规PCR 方法敏感。

3 讨 论

SCRV 具有很强的传染性、流行性和致病性，可感染鳜鱼、生鱼、加州鲈等多种鱼类[11]。目前国内外关于弹状病毒基于G 蛋白、N 蛋白建立的检测方法最为常见[12-14]，对于鱼类弹状病毒，尤其SCRV的研究较少。SCRV 分离鉴定方法耗时长，周期较长，不利于该病的快速诊断，常规PCR 敏感性较低，不能够对病毒进行快速、灵敏、准确地检测分析[15]。因此，建立快速检测SCRV 的方法并应用，对预防鱼类感染SCRV 及减少养殖户经济损失显得十分重要。荧光定量PCR 技术可分为荧光染料(SYBR GreenⅠ)法和TaqMan 探针法，具有灵敏度高、特异性好、可靠性强和实时准确等特点，目前是实验室重要的检测技术[16]，但SYBR

GreenⅠ对DNA 模板无选择性，能够与所有的DNA 双链相结合，因此特异性比TaqMan 探针差。TaqMan 探针法的定量PCR 反应体系中包含一对PCR 引物和一条探针，探针只与DNA 模板特异性结合，其结合位点在两条引物之间，避免了假阳性问题，同时可通过模板的Ct 值与模板起始拷贝数的对数对起始模板进行定量[17-18]，而且针对SCRV 建立的实时定量的检测方法也很少。

由于N 蛋白是弹状病毒5 个结构蛋白中一个较为保守的蛋白，所以本研究针对SCRV 的N 蛋白基因的保守区设计特异性引物及TaqMan 探针，建立SCRV 的TaqMan 荧光定量PCR 检测方法，该方法标准曲线相关系数 R2 为 0.999，在

108 拷贝 /μL～101 拷贝/μL 范围内有较好的线性关系；以上研究表明该方法可以高效的检出病毒；此外，该方法对鱼类其它病毒检测结果为阳性，例如ISKNV、GCRV、KHV、SGIV、TiLV、NNV、SVCV，证实该方法的特异性强。该方法与许运斌等以基因Ⅰ型狂犬病病毒(Rabies virus，RV)N 基因建立的TaqMan 荧光定量检测方法特异性结果相当，均对其它病毒样品无阳性信号[19]；组内变异系数在0.303 %～1.587 %，组间变异系数在0.601 %～0.748 %，组内和组间变异系数均小于2 %，表明该方法具有较高的重复性和较好的稳定性；曾伟伟等研究发现SCRV 与杂交鳢弹状病毒 C1207 株(Hybrid snakehead rhabdovirus-C1207，HSHRV-C1207)亲缘关系较近，但二者在病毒特性方面存在差异，因此，针对保守基因的保守序列设计引物和探针更有必要性[20]。刘春等根据HSHRV-C1207

G 蛋白建立的TaqMan 荧光定量 PCR方法也可检测SCRV，其主要针对糖蛋白设计引物和探针，但弹状病毒糖蛋白的相对变异性较大[12]。本研究建立的SCRV 荧光定量PCR 检测方法最低可检测到100 拷贝/μL，比常规PCR 方法灵敏100 倍，与岳志芹等建立的传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoieticnecrosis，IHN)的 N 基因 TaqMan荧光定量PCR 检测方法结果相似[22]。因此，本研究建立的TaqMan 荧光定量PCR 检测方法可以更加快速、特异检测出SCRV，便于及时防控该病，减少经济损失。 应用本研究建立的TaqMan 荧光定量PCR 方法对来自广东东莞、佛山等地的35

份临床样品进行检测，结果显示阳性检出率为31 %，比常规PCR 阳性检出率高，证实建立的TaqMan 荧光定量PCR 检测方法在临床检测应用中的可靠性和敏感性均较高，可以用于SCRV 的快速检测。

本研究建立的TaqMan 荧光定量PCR 检测方法，具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，能够快速、准确地对SCRV 进行定量分析，对鳜鱼弹状病毒的快速检测及防控该病具有重要意义。

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