一种抗新型冠状病毒灭活血浆的制备及质量标准的建立

2024年1月25日发(作者：奇瑞瑞虎八2020款价格)

国际生物制品学杂志 2021 年 2 月第 44 卷第 1 期 Im J Biologicals，February 2021，Vol. 44, No. 1?

17 ??新型冠状病毒专题?一种抗新型冠状病毒灭活血浆的制备及质量

标准的建立胡勇，余鼎2吴晓1丁亚凌6卢佳3喻剑虹1李伟6杨晓明4何彦林2韩初1张勇6李策生1段凯3梁小龙1朱晨1付道兴2杨汇川4邢延涛1邓志军1侯继锋5刘莹1陈克金1梁洪2郑宵蓓1詹骞1彭[李陶敬2周志军1吴强6王泽鋈3林连珍1

江砚芳6

孟胜利3

卢奎林61国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部430207; 2北京天坛生物制品股份有限公司

研发中心100024; 3武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室430207; 4中

国生物技术股份有限公司科研管理部，北京100029; 5中国食品药品检定研究院血液制品

室，北京102629; 6成都蓉生药业有限责任公司科研开发部610041

胡勇和余鼎对本文有同等贡献通信作者：杨晓明，Email:

yangxiaoming@;李策生，Email:

licesheng

@sinopharm.

com;付道兴，Email:

fudaoxing@【摘要】目的建立一种以新型冠状病毒肺炎（COVIEM9)康复者恢复期血浆为原料制备抗新型

冠状病毒(2019

novel

coronavirus，2019-nCoV)灭活血裝的工艺及其质量标准。方法采集2020年1一

3月期间中国武汉441人份C()VII>19康复者捐献的恢复期血浆，开展2019-nCoV、HIV和梅毒螺旋体

等病原体的筛查，进行亚甲蓝光照灭活，并通过检测蛋白含量、抗2019-nCoV抗体、凝血因子1活性等，判断亚甲蓝光照灭活对血浆的影响并建立质量标准。结果亚甲蓝光照灭活前后灭活血浆的蛋白含量

没有发生明显变化，血浆的凝血因子《含量>().50

IU/ml，抗体滴度未出现明显下降，各项检测结果均

符合质量要求。结论确立了以C()VII>19康复者恢复期血浆制备抗2U19-nCoV灭活血浆的关键质量

控制及工艺参数。【关键词】新型冠状病毒肺炎；新型冠状病毒；亚甲蓝；病毒灭活

基金项目：国家科技部重点专项(2()2()YFC()841800)【中图分类号】R563.1

DOI： 10. 3760/cma.

j.

cn311962-20201018-00098Preparation and establishment of quality standard for an anti-2019 novel coronavirus inactivated plasmaHu Yong\' , Yu Ding2 , He YanLin2 , Duan Kai3, Yang Huichuan4, Houjifeng、Xing Yantao1, Liu Ying1, Zhe?7^ Xiaobei1, Lu Kuilin6， Wu Qiang6,

Liang Hong2 ,

Zhou Zhijun1 , Lin Lianzhen 1 , Wu Xiao1 , Yu ] ianhong

， Han Ren1 , Liang Xiao long1 ,

Jiang Yanfcmg6,Ding Yaling6 , Li Wei6 , Zhang Yong6 , Zhu Chen \' , Deng Zhijun 1 , Chen Kejin 1 , Zhan Qian2,

Li Taojing2 , Wang Zejun}, Meng Shengli3, Lu Jia3 , Yang Xiaoming4, Li Cesheng1, Fu Dauxiji^2

\'Research and Development Department >, Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co., Ltd.,

Wuhun 430207，China; 2Research and Development Center，Beijing Tiaritcm Biological Products Co.，

Ltd.，Beijing 100024，China; 3Laboratory 2 of Viral Vaccine Research，Wuhan Institute of Biological

Products Co.，Ltd.-, Wuhan 430207 ^ China; 4 Research and Development Management Department ^

China National Biotec Group Co.^ Ltd.-, Beijing 100029, China； ^Blood Product Department ^

National Institutes For Food and Drug Controls Beijing 102629, China； hResearch and Development

Department，Chengdu Rongsheng Pharmaceuticals Co.，Ltd.，Chengdu 610041，China

Hu Yong and Yu Ding have contributed equally to the article

?

18 ?国际生物制品学杂志 2021 年 2 月第 44 卷第 1 期 Int J Biologicals，February 2021，Vol. 44. No. 1Corresponding authors ?? Yang Xiaoming ^ Email： yafigxiaoming @ sitiophann. com； Li Cesheng *

Email-. ***********************； FuDaoxing, Email： fudaoxing@【Abstract】 Objective To explore the production and quality standard of an inactivated plasma of

anti-2019 novel coronavirus (2019-nCoV) prepared from convalescent plasma of COVID-19 patients.

Methods Four hundred and forty-one convalescent samples were collected from COVID-19 patients in

Wuhan, China from January to March 2020, and screened for pathogens including 2019-nCoV, HIV,

Treponema pallidum and so on. Qualified plasma samples were inactivated by methylene blue light. By

carrying out protein content of plasma, anti-2019-nCoV antibody, coagulation factor 1 activity and other

testvS, the effect of methylene blue light inactivation on plasma was determined and the quality standard

was established. Results Protein content of inactivated plasma did not change significantly before and

after methylene blue irradiation inactivation, Coagulation facctor VH activity was X). 50 IU/ml. Antibody

titer did not show a significant decrease. All test results met the quality requirements. Conclusion The

key quality control and process parameters of anti-2019-nCoV inactivated plasma prepared from the

plavsma of COVIEH 9 convalescent patients are established.【Key words】 GOVIEH% 201() novel coronavirus; Methylene blue; Virus inactivationFund program： Key Project of the Ministry of Science and Technology of China (2020YFC084180)DOI： 10. 3760/cma. j. cn311962-20201018-00098新型冠状病毒肺炎(C0VII> 1 y)是由新型冠状病

毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)感染引起的急

性传染性疾病w。2m9\"nCoV为有包膜的单股正链

RNA病毒，主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播，也

可能通过气溶胶和消化道（獎-口）等途径传播[2]。

a)vn>i9患者会出现发热、干咳、咽痛、呼吸困难、乏

力等症状，重症者会迅速出现急性呼吸窘迫&4]、脓毒

症休克[5]以及凝血功能障碍等，甚至死亡M。C()VII>19康复者恢复期血浆治疗是将从治愈

患者血浆中提取出的抗体或经过灭菌等处理的恢复

期血浆输入患者体内.识别并清除病毒，在尚无特效

药的情况下成为了一种能明显改善患者疾病症状的

优选方案。血浆病毒灭活技术是阻断经血液传播疾

病的有效手段，使用病毒灭活血浆可以有效控制经

血液传播疾病，保证临床输血的安全。目前,亚甲蓝

光化学法（methylene blue photochemistry，MB~P)是我国唯一获批用于临床的光化学血浆病毒灭活技

术，是一种实用、安全、有效的单袋血浆灭活方法[7]。

MB-P能杀灭HIV、HBV和HCV等脂包膜病毒和

部分非脂包膜病毒。本研究采集COVII>19康复者的恢复期血浆，

对其完成2019-nCoV、HBV、HCV、HIV和梅毒螺

旋体等常见病原体的筛查后，采用MB-P对该血浆

进行病毒灭活处理以制备成可特异中和2019-nCoV

的灭活血浆，并对主要指标进行检测，建立灭活血浆

的质量标准。1材料与方法1.1主要设备与试剂FLY/XJ-1和H.Y/XJ-2血浆采集机购自重庆

三大伟业制药有限公司，NGL-XJC 2000血浆采集

机购自四川南格尔生物医学股份有限公司，DRH

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物科技有限公司。20200123C凯杰核酸提取试剂盒

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冠状病毒核酸检测试剂盒购自上海捷诺生物科技有

限公司。1.2 COVII>19康复者恢复期血浆的采集与检测

1.2. 1恢复期血浆的采集恢复期血浆采集于

2020年1—3月武汉地区441例COVII>19康复捐

献者。采集对象满足以下条件:（1)距首发症状时间

不少于3周；（2)符合国家卫生健康委员会发布的最

新版COVK>19诊疗方案中解除隔离和出院标准；

(3)年龄满18岁，且不超过55岁；（4)男性体重不低

于5() kg，女性体重不低于45 kg; (5)无经血液传播

疾病史；（6)经临床医师综合患者治疗等有关情况评

国际生物制品学杂志2U21年2月第44卷第1期 Int J Biologicals, February 2021 , Vo丨.44, No. 1?

19 ?估可以捐献血浆。1.2.2恢复期血浆的检测捐献者签署知情同意

书后，使用单采血浆技术每次采集血浆2U0?4U0 ml

留样检测。两次采浆间隔期<14 d。采用实时荧光定

量PCR进行2019-nCoV核酸检测，采用折射法检测

其蛋白含量，采用正定法进行ABO血型定型/RhD血

型定型，采用赖氏法检测其丙氨酸酶含量，采用

ELISA与核酸检测法检测其HBV、HCV和HIV标

志物，采用ELISA检测梅毒螺旋体标志物。1.3抗2019-nCoV灭活血浆的制备将血浆连接病毒灭活装置，让血浆通过亚甲蓝添

加元件吸入亚甲蓝，后流人光照袋，待光照袋内血浆

净重为(ll(>±5)g时关闭止流夹，热合封闭进浆管。

使用30 000?40 000 Lx光照强度的可见光有效光照

3() mm，然后，将含亚甲蓝的血浆流经吸附过滤部件

以去除残余的亚甲蓝和白细胞，分段热合封闭，留样

检测。1. 4抗2019-nCoV灭活血浆的检测

1.4. 1抗2019-nCoV抗体检测分别采用ELISA

和病毒噬斑减少中和试验法检测。EUSA采用基

于2019-nCoV表面刺突糖蛋白受体结合域

(receptor-binding domain, RBD)而设计的 RBD~

ELISA试剂盒，该试剂盒可以捕获血浆中能结合

RBD 的抗 2019-nCoV 抗体。1.4.2血浆蛋白含量检测应用免疫透射比浊法

检测血浆蛋白含量。1.4.3凝血因子1活性检测应用全自动血凝分

析仪测定凝血因子《的含量。1.4.4灭活血浆的无菌检测采用直接接种法逐

袋测定，测定结果无菌视为符合规定。1. 5抗2019-nCoV灭活血浆质量标准的建立

依据中华人民共和国国家标准《GB 18469—

2012全血及成分血质量要求》M和病毒灭活新鲜冰

冻血浆质量控制项目要求，对灭活血浆的凝血因子

1活性、亚甲蓝残留量及无菌试验设置标准。基于本研究检测结果发现，约恢复期血浆

的 RBI>ELISA 滴度>1 : 160,并结合 2019-nCoV

RBI>EUSA与噬斑减少中和试验用于国外其他类

似疾病的康复者血浆检测中的经验，选择灭活血浆

滴度>1 : 16()为符合质量标准。1.6统计学分析采用Excel 2016的线性回归和Spearman秩相关分析2(>iy-nCoV的RBI>ELISA与噬斑减少中

和试验结果的相关性。对满足方差齐条件的血浆蛋

白含量结果开展配对〖检验，P >(U>5表示差异无统

计学意义。2结果2. 1 C()VII>19康复者恢复期血浆的检测概况本研究共采集武汉市441份COVII>19康复者

恢复期血浆，累计制备1 216袋抗2019-nCoV灭活

血浆。合格血浆占总数的86. 4%(381份），不合格

血浆（HBV、HCV、梅毒螺旋体阳性，丙氨酸酶含量

>25 g/L，抗 2019-nCoV 抗体滴度<1 : 160 中任一）

仅占13. 6 %，且89. 2%的恢复期血浆中抗2019-

nCoV抗体滴度>1 : 160,合格血浆的抗2019-nCoV

抗体滴度均>1 : 160,为血浆治疗COVIFM9的质

量标准奠定了基础。2.2灭活血浆中蛋白含量的检测情况由表1可知，COV1CH9康复者恢复期血浆经亚

甲蓝光照灭活前后，主要蛋白含量均未发生明显变

化。配对，检验的P值均>()? 值为-1. 387?3. (>5(>，表明血浆灭活前后主要蛋白含量之间的差异

均无统计学意义。2.3灭活血浆中凝血因子1活性的检测情况依据《?3/丁 623—2018全血和成分血使用》[9]

要求，参考病毒灭活新鲜冰冻血浆标准，血浆中凝血

因子1活性应>〇. 50 IU/ml。由表2可知，3批

C()VII>19康复者恢复期血浆经MB-P灭活后，凝

血因子1水平虽有下降，但均>().5() IU/ml，符合质

量要求，且灭活后的活性回收率均>50.0%，说明亚

甲蓝光照技术可以应用于COVICM9康复者恢复期

血浆的灭活。表2新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆的凝血因子in活性检测概况血浆活性/(IU/ml)活性回收率/%202()()2()501灭活前1. 20灭活后0. 6050. 02()20()20502灭活前1. 18灭活后0. 6756. 8202()()2()503灭活前0. 8268.3灭活后0. 56

? 20 ?国际生物制品学杂志 2021 年 2 月第 44 卷第 1 期 Int J Biologicals, February 2021, Vol. 44. No. 1表1血浆2020020501灭活前灭活后2020020502灭活前灭活后202()()2()503灭活前灭活后9. 039. 111.971.971.021.008. 208. 171.741.700. 860. 8611.811.62. 272.251.741.74IgGIgMIgA灭活血浆中亚甲蓝灭活前后血浆蛋白的含量(g/UTRFALBAATa2MHPTAAGCERFIBPISAT3FNCCl I2.522. 5139.238.81.331.321.781.771.061.010. 7290.7180. 2750. 2703.283. 290. 1260. 1260. 3100. 3000.460. 470. 2590. 2621.711.7128.227.70. 860. 851. 171. 150. 660. 650. 4810. 490. 1400. 1462. 302. 340. 0930. 0910.2150.2170. 270. 280. 1850. 1831.831.8329. 928.80. 930. 971.301.330. 770. 760. 520. 520. 160. 172. 322.320. 0990. 0960. 2250. 2210. 190. 200. 2040. 205注：Ig:免疫球蛋白；TRF:转铁蛋白；ALB?.白蛋白；AAT: al-抗胰蛋白酶；a2M: a2-巨球蛋白；HPT:触珠蛋白；AAG: a1-酸性糖

蛋白；CER:铜蓝蛋白；FIB:纤维蛋白原；PLS:纤维蛋白溶酶原；AT3:抗凝血酶ffl; FNC:纤维连接蛋白；C1I: C1-酯酶抑制剂2.4灭活血浆中抗体滴度的检测情况分别采用基于RBD的快速ELISA和病毒噬斑

减少中和试验法检测抗2019-nCoV抗体的滴度，结

果显示，20—24样本中两种检测方法的检测结果均

为阴性。ELISA结果取对数（log2)作为横坐标，病毒噬

斑减少中和试验法检测结果取对数(l〇g2)作为纵坐

标，绘制线性回归图（图1)。对两种方法检测结果

进行相关性分析，决定系数= ().745，表明两种方法

具有良好的相关性。2.5无菌检查将灭活血浆逐袋取样进行无菌接种，按照医疗

机构临床实验室血培养指导原则和操作指南孵育

7 d后进行无菌检测，结果发现所有样本均为无菌状

态，说明灭活血浆经亚甲蓝光照灭活符合无菌要求。

2. 6质量标准为了保证2019-nCoV灭活血浆的临床安全性，

本研究首先依据病毒学标准检测采集的COVII>19

康复者恢复期血浆，要求血浆中的HBV、HCV、

HIV、梅毒螺旋体以及2019-nCoV均为阴性，且丙氨酸氨酶含量<25 g/L。对满足条件的血浆进行亚

甲蓝光照灭活，要求灭活血浆无菌检查结果为阴性，

进一步保障血浆的安全性。经实验确定灭活血浆的

抗2()19-nC〇V抗体滴度>1 : 160为合格标准。综

上，若采集的康复者恢复期血浆及灭活血浆均满足

上述要求，视为血浆合格。3 i寸论仅筛查血浆而不进行灭活处理，会产生病毒传

播的风险，如根据相关报道，献血者中HBV的残余

风险度在意大利为1 : 71 942、美国为1 : 280

()(>()、

德国为1 : 620 00();HIV在西班牙为1 : 550 00()、

加拿大为1 : 7 8()(> 000[m]。本研究采用临床上成

熟的亚甲蓝病毒灭活技术对恢复者血浆进行灭活，

旨在减少病毒传播风险，提升输血安全性。侯丽等[u]研究发现亚甲蓝光照对菌株和细胞

均无诱变性，其他研究也证实患者输入亚甲蓝光照

灭活血浆引起的过敏反应与其他血浆的发生率相

似[12]，且该技术在欧洲已经使用二十余年，综合表

明亚甲蓝灭活血浆病毒具有较高的安全性，可应用

于临床。6.0 7.0 9.0 10.0

logj ELISA滴度值8.0 11.0 12.0

注：炉：决定系数图1 EUSA与噬斑减少中和法测定抗体滴度的试验结果相关性由表3可知，COVICM9康复者恢复期血浆经

亚甲蓝灭活前后，抗2019-nCoV抗体滴度均>

1 M60,且灭活前后病毒的抗体滴度无明显变化，结

果符合质量要求。表3亚甲蓝灭活前后抗新型冠状病毒抗体滴度结果比对灭活前^1：640：320>1:128 0灭活后^1 ： 640>1 ： 320彡1 : 128 ()标准^1 ： 160>1 ： 160^1 ： 160血架编号200205022()2002()503

国际生物制品学杂志 2021 年 2 月第 44 卷第 1 期 Int J Biologicals，February 2021，Vol. 44，No. 1?

21 ?本研究应用MB-P对COVII>19康复者的恢复

期血浆进行病毒灭活，并对灭活血浆进行质量检测

和质量标准建立，结果发现血浆灭活后的主要蛋白

未发生大量流失，灭活后血浆的凝血因子?含量>0.50 IU/ml，符合中华人民共和国卫生行业标准

《WS/T 623—2(_)18全血和成分血使用》M要求；灭

活后血浆中抗2019-nCoV抗体的滴度也未出现明

显下降，且COVII>19康复者的恢复期血浆经MB-

P处理后得到的血浆成品未检测到菌体污染。以上

研究结果均与中国药典2015年版三部及《GB

18469—2012全血及成分血质量要求》相符。综上研究得出，抗2019-nCoV灭活血浆的质量

标准建立为:原料COVII>19康复者恢复期血浆中

的2(M9-nC〇V和常见经血传播病毒检测呈阴性，丙

氨酸酶含量<25 g/L，制备的灭活血浆要求无菌，抗

2019-nCoV 抗体滴度 >1 : 160。从长远来看，将COVII>19康复者恢复期血浆

或COVIEM9疫苗免疫后健康人群血浆中的抗

2019-nCoV抗体大批量混合制备成更加高效价的

特异性免疫球蛋白为更优方案，但考虑到该产品制

备需要大量血浆原料和工业化规模设备，制备周期

比较长，不适合用于临床大批量使用和战略储备。

因此,使用本研究建立方法制备的COVII>19灭活

血浆进行临床紧急救治，仍属于最快且经济有效的

特异性治疗手段之一。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献[1 ] Zhou P, Yang XL, Wang XG, et al. A pneumonia outbreak

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