生物体内有四种主要的大分子

2023年12月22日发(作者：福特领界suv价格及图片)

生物体内有四种主要的大分子，分别是核酸、蛋白质、脂类和糖类。核酸和蛋白质都是线性结构，分子间以单一的酯键或肽键相连，所以已经建立起十分成熟的研究方法。而糖类却有不同的特点。首先糖链高度分枝，单糖能够彼此以多种不同的键连接，所以聚糖的结构及其复杂；其次，在生物体内，糖类一般不单独存在，而是连接在蛋白质或脂类分子上。这些化合物称为糖蛋白或糖脂。

1990年11月，三个小组同时发现了血管内皮细胞－白细胞黏附分子1（ELAM－1），后改称E选择蛋白（E－selectin），能识别白细胞表面的SLex(一种血型抗原）四聚糖。当组织受损或感染时，白细胞黏附于内皮细胞，沿血管壁滚动并穿过管壁进入受损组织，杀灭入侵病原物，但过多的白细胞聚集，则会引起炎症及类风湿等自身免疫疾病。这是糖结合蛋白与寡糖识别作用的首次确证。更令人吃惊的是，在肺癌和大肠癌细胞表面也存在SLex。这一革命性的进展，导致了糖工程的兴起，引发了一场制备抗炎和抗癌药物的大竞赛。

当基因工程和蛋白质工程药物的生产正如火如荼时，人们惊奇地发现，很多糖蛋白药物在不同细胞中表达所得的产物，其免疫原性、半寿期、生物活性等各不相同，原因就是糖基化的不同。如何使表达产物进行合适的糖基化这一问题的提出，促使了糖基化工程（glycosylation engineering）这一新领域的产生。糖基化工程的研究，主要集中于糖蛋白糖链功能的分析和糖基化表达体系的构建。如科学家将昆虫细胞改造后，可表达正确的糖链；日本Kirin公司则准备改造酵母。可以预见，糖基化工程研究在理论上可阐明糖链的功能，在实践上则可为解决基因工程药物的免疫原性、生物活性及药物设计等问题提供指导。

一、蛋白上糖链的结构

糖蛋白上的糖链从连接方式上可分两类：一类是与天冬氨酰（Asn）残基连接，即N-连接糖蛋白，另一类与丝氨酸或苏氨酸连接，称为O-连接糖蛋白。一般来说，O-糖链不含甘露糖，而N-糖链总含有大量的甘露糖，因此，通过分析单糖的组分，便可知两者的分布组成情况。

N-糖链通常都有一个五糖核心│ Manα1→6(Manαl→3)Man β1→4GlcNAc β1→4GlcNAc │（（Man）3（GlcNAc）2），根据它们的外层链(Outr Chain)结构的不同，可分为：高甘露糖型(High mannose)，杂合型(Hybrid type)与复合型(CoMplex type)。如图l所示，三者之间的区别在于：高甘露糖型只含有多个α连接的甘露糖残基，而复杂型具有以盐藻糖（Fuc）、半乳糖（Gal）和唾液糖（SA）为组分的糖链天线，杂合型则兼由有两种特点。许多研究表明：三种类型的糖链具有共同的生物合成起源，即高甘露糖聚合物前体。它不是直接在蛋白质上合成出来的，而是连到一个脂质载体多萜醇（Dol）。完成的寡糖链从Dol转运到蛋白质受体。在许多系统中，脂质连接的前体寡糖链都存在（Glc）3（Man）9（GlcNAc）2 的结构，在CHO细胞中也已经检测到。

O-糖链根据其核心结构的不同可分为四个亚型,如图2所示。

二、糖基化作用机制及影响因素的研究

寡糖链前体的合成以（GlcNAc）2-P-P-Dol开始，然后Man以β1→3加入（GlcNAc）2-P-P中，此反应需要以GDP-Man为供体。随着chapman等在CHO细胞中发现从Man(GlcNAc)2到（Glc）3（Man）9（GlcNAc）2的系列片断，这符合（Glc）3（Man）9（GlcNAc）2逐步添加装配过程。最后Glc连接到寡糖链上，形成最终的前体物。在寡糖链转送到蛋白质过程的研究中，人们发现，糖基化的Asn位于Asn-X-Thr（Ser）的三肽序列中，其中X是除了Pro以外的任一种氨基酸。但这种结构专一性不强，在体外实验中，用β-羟基正缬氨酸（与Thr只有一个甲基差别的类似物）代替Thr，只能抑制糖基化的30％。而且并不是所有的Asn-X-Thr结构都能够被糖基化。人们发现如果一个肽片断具有如下的条件：（1）存在Asn-X-Thr(Ser)序列；（2）-COOH和-NH2末端被修饰，就能在体外被糖基化。

图1：N-连接型糖蛋白的三种类型 图2：N-连接型糖链的四种核心结构

许多人认为，分泌性糖蛋白是在与膜相连的核糖体内合成的，然后穿过粗糙内质网（RER）。卵清蛋白和小鼠IgG重链上的糖链上的糖基化发生在蛋白质释放出核糖体以前。有些在多肽链合成后糖基化。许多证据都支持以下的观点：（1）糖蛋白最先在囊腔表面发现；（2）蛋白质在无细胞体系内翻译时，没有膜的参与，不能被糖基化。

Asn的糖基化几乎总是作用于Asn-X-Ser(Thr)。Bause和legler认为在糖基化反应中，在羟基氨基酸残基的侧链上，须形成一个氢键才能反应。合适的构象可形成必需的氢键，可与糖链转移酶充分接触。另外影响糖基化的因素是脂连接寡糖的供体多少。Carson发现，增加Dol-P可将分泌性RNase的糖基化程度从12%增至90%。Dol-P多少在一定程度上可调节糖基化的程度。同时，寡糖转运酶的活性水平也影响蛋白质糖基化的程度。

寡糖反应途径如下：前体物（Glc）3（Man）9（GlcNAc）2从脂供体在穿过RER膜时转到新生肽的Asn上，加工过程是以一个特异α1→2葡萄糖酶去除葡萄糖末端开始的。然后内部的两个葡萄糖残基被α1→3葡萄糖酶II切除，这些葡萄糖酶和α??-甘露糖酶都位于RER上。在RER中，膜蛋白和分泌性糖蛋白都经历相同的过程。有人推测，葡萄糖修饰的目的是为了更有效的将蛋白从RER运到Golgi体。

糖蛋白到达Golgi体后，那些最终成为复合性结构的寡糖，通过N-已酰葡萄糖胺转移酶I添加N-已酰葡萄糖胺残基，由Golgi体内的α-甘露糖酶II切除两个甘露糖残基，随后由GlcNAc转移酶加入天线上的GlcNAc残基。同时，Fuc转运酶可能转运一个Fuc到糖链的GlcNAc上。复合型寡糖的合成最后步骤发生在Golgi体的反面囊腔中。此时Gal或SA转运酶催化添加Gal和SA。最后新合成的糖蛋白离开Golgi体，运送到最终目的地。

最终的寡糖结构在很大程度上取决于糖蛋白在处理过程中与糖基化酶和糖基化转运酶的作用顺序，以及它们特异性作用，许多不同的酶催化不同的反应，最后形成最终的寡糖结构。

为了探讨寡糖合成加工过程中的控制因素，人们作了大量的实验。从不同种类、不同组织中产生的同一种蛋白，对其寡糖分析有很大的差异。在上述讨论中，特定的N-连接寡糖的合成取决于各种糖基化酶的表达水平，在不同的细胞和组织中，这些酶的相对活性的差异形成不同的寡糖结构。虽然大多数细胞都有能力将相同蛋白连接的寡糖加工成很多不同的结构，如高甘露糖型、复合型等。实际上，单个糖基化位点趋于有一个特征性的寡糖结构，而且可与同一蛋白的其它位点的糖链相区别，其中一个原因是蛋白质在细胞中定位。因此，留在RER上的糖蛋白，没有接触Golgi体酶系，只有高甘露糖型。排出Golgi的糖蛋白由于其大小、构型等方面的因素从而形成不同的糖链结构。同样，与宿主相关的因素也影响寡糖的加工过程。Hsieh等分析了Sindbis病毒在三种不同的宿主细胞中生长时，产生的糖蛋白两个位点的寡糖结构。他们发现，一个位点只有复合型糖链，与宿主无关，而另外一个位点在鸡胚成纤维细胞中是高甘露糖型，在BHK细胞中为复合型，而在CHO细胞中二者都有。Hsieh认为，在不同的宿主细胞中出现差异的原因可能是由于细胞内加工酶的不同，或糖蛋白在细胞内转运的时间不同，或是加工过程中能否有效接触造成的。

另外，细胞中的蛋白质，即使经历相同的糖基化机制和分泌途径，也并非所有的潜在位点均可被糖基化，据估计有10％－30％的潜在糖基化位点不能糖基化。实验进一步表明，不同类型N—糖链的分布也存在着糖基化位点的专一性。如鼠脑Thy-l蛋白，其Asn23仅能为高甘露糖型糖链，Asn74可为杂合型或复杂型糖链，而Asn98则能为任一种N-糖链。因此生物体内的确存在某些因素控制着蛋白质的糖基化，包括：(1)蛋白质的氨基酸序列决定着潜在糖基化位点的分布和数目。例如，EGF模体(motif)中恒定序列CGS／T常能被O-岩藻糖基化。(2)在糖蛋白的生物合成过程中，糖蛋白的折叠方式，即蛋白质的三维空间结构，影响糖基转移菌与蛋白表面特定序列的接触，从而引起糖链的延伸和添加糖基的不同。(3)合成糖蛋白细胞中糖基转移酶及相关酶类的表达类型。(4)细胞中不同糖链加工区域的排列，以及糖链通过这些区域的速率。

因此，糖链加工的控制过程是非常复杂的，而不是简单的某一方面所能决定的。

三、糖链的生物学功能

糖蛋白中的蛋白质是其生理功能的主要承担者，而糖链则对蛋白质的功能起修饰作用。这种修饰作用极其多样化，斯坦利（P. Stanley）指出，这种作用有两大类：分子内作用，如蛋白质的正确折叠、细胞内定位、生物活性、溶解度、抗原性、生物半寿期、蛋白酶敏感性等；分子间作用，如趋靶于溶酶体、趋靶于组织、细胞－细胞黏附和结合病原体等。归根结底，是糖影响着蛋白质的整体构象，从而影响由构象决定的所有功能。

甘贝里（C. G. Gahmberg）等于1996年发现，非正确折叠的肽链不能从内质网腔外出并分泌到细胞外表面。与翻译同步的肽链N－糖基化过程在内质网内腔进行，而翻译后的修饰则在高尔基体内腔进行。N－

糖基化的共同前体是寡糖的最内部的一个葡萄糖，两个细胞内凝集素在内质网内腔中与它结合，把糖蛋白阻留在内质网内，等糖基化完成后再移到膜外。

免疫球蛋白IgG的结构与功能早已为人所知，但对其中糖链的作用却了解不多。直到1981年，戴森霍弗（J. Deisenhofer）才通过X射线晶体分析，确定了IgG的Fc片段上CH2结构域的糖链结构。二天线的N－糖链连接在每个重链的Asn297上，两个CH2结构域之间有较大空间，糖链即栖身其间。这两个N－糖链有30多种不同的糖型，科学家认为，这是由于人类个体有一系列表达不同糖基转移酶的B细胞系所致。1985年，木幡（A. Kobata）发现，类风湿关节炎患者的IgG糖链中缺少半乳糖。他与德韦克合作多年，终于确证了这种缺乏半乳糖的IgG会发生构象变化，使人体把它当作异物，在血管、关节等处被甘露糖结合蛋白识别，发生免疫复合物的沉积，从而引发类风湿关节炎。脊推动物垂体前叶分泌的促卵泡激素（FSH）、黄体生成素（LH）、促甲状腺素（TSH），以及灵长类胎盘细胞分泌的绒毛膜促性腺激素（CG），是一族同源糖蛋白激素。这类糖蛋白均由α和β两个亚基组成，亚基上的糖链影响激素的生物活性、在血液中的半寿期、亚基的正确折叠及激素信号传入细胞的过程。

许多酶的活力依赖其糖链部分，在当衣霉素存在或在细菌内表达的溶酶体β-葡萄糖苷酶只有免疫原活性而完全没有酶活力时，羟甲戊二酰（HMG）CoA还原酶去糖基化后可降低90%以上。膜蛋白质酶N-糖链的核心五糖为活力所必需，而外链部分则对活力的贡献不大。

糖链能阻止基因工程表达的糖蛋白产物的聚集：在真核细胞中表达的产物因带有复杂型(如哺乳动物细胞产物)或高甘露糖型(如酵母细胞产物)糖链，蛋白可不发生聚合而分泌出细胞外；而在缺乏糖基化体系的大肠肝菌中表达的非糖基化蛋白，则常聚集成不溶性包涵体形式存在，很少分泌出细胞，所以糖蛋白表面的糖链有助于蛋白质的溶解，防止肽链聚集的作用。

又如，促红细胞生成素(EPO)是由肾脏产生刺激骨髓红细胞成熟和增殖的激素。其天然来源十分有限，目前大多用基因工程的方法生产。从人尿中提取的天然EPO在Asn24、Asn38和Asn83上各有一条N-糖链，在Ser126位点上有一条O-连接糖链，为四天线和部分三天线的复杂型N-糖链。糖链的含量约占EPO分子量的40%，具有高度不均一性。通过基因重组表达的EPO(rhEPO)，若NeuAc完全或部分去除后，在体内能很快地被肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体摄取，故而在体内几乎不体现活性，可见NeuAc对EPO在体内的半衰期影响极大。由于EPO去除SA后在体内很快分解而丧失活力，故基因重组的EPO（rhEPO）均在高等真核细胞中表达，如CHO、BHK、Hela和C127细胞中。

另外，由某种中国仓鼠卵细胞(CHO)表达的二天线糖链的hEPO，即使糖链末端被唾液酸化，在体内的活性仍较弱，远远低于四天线糖链的天然hEPO。

组织纤溶酶原激活剂（t-PA）有两种类型，I型t-PA在Asn117，Asn184，Asn448位点上各有一条N-连接糖链。在从Bowes黑色素瘤细胞中提纯的t-PA其117位点上主要是高甘露糖链，184位点上也是高甘露糖为主，兼有中性或酸性复杂性糖链，而448位点是中性的复杂型或杂和型糖链。II型t-PA缺失Asn184上的糖链，且448位点上有72%为硫酸化的复杂型N-糖链，与I型的448糖链明显不同。I型t-PA中增加的184糖链可导致下述变化：（1）受水解酶作用使t-PA从单链向双链转向时（t-PA的ARG275，Ile276间链被水解）的速度较II型降低，表现为催化常数和米氏常数的降低。（2）和纤维蛋白中Lys残基的亲和力降低，以致在纤溶酶存在下水解纤维蛋白的速度也较II型为低。

人粒细胞-巨噬细胞的集落刺激因子（hGM-CSF）能促进粒细胞-巨噬细胞的分化和增殖。CSF都是糖蛋白，是目前治疗白细胞减少症的最佳药物。hGM-CSF由127个氨基酸残基组成，多肽链分子量约14500。含有两条N-连接糖链和一条O-连接GalNAC糖链。在酵母和CHO细胞中表达的hGM-CSF去寡糖链后活性将增加。在衣霉素存在下，人Namalwa淋巴母细胞样细胞中表达的hGM-CSF用不同量的内糖苷酶处理可获得2个（2N）、1个（1N）或没有（0N）N-糖链而带O-GalNAc糖链的hGH-CSF。以大肠杆菌中表达的无糖链hGM-CSF为对照，比较其体外的比活性和血中的消失速度，发现N-连接糖链越多，体外比活性越低，而在血中的滞留时间越长，提示N-糖链主要是防止体内的清除。

表1：糖链数目对hGM-CSF活力和清除速率的影响

hGM-CSF来源 体外比活（U/mg） 血中消失时间（h）

大肠杆菌中的表达物 1.9×109 7.5

Namalwa淋巴母细胞样细胞表达物 2N 8.6×106 48

1N 7.4×107 -

0N 2.8×109 11

四、糖基化分析

进行糖基化的研究，要判断糖基化的位点、数目、类型、单糖的组成及糖链的结构等情况。除少数情况外，真核生物糖蛋白的每一个糖基化位点都连接着不同的糖链，称为糖链的微观不均一性。由多个糖基化位点是否糖基化而造成的差异，称为宏观不均一性。因此真核生物糖蛋白的分离纯化产物，不是单一的物质，而是一系列多肽链相同糖基化的混合物。

4.1糖基化位点识别

糖基化位点识别有三种方法：（1）氨基酸序列分析法：潜在的位点糖基化情形可以检测出来，但用于检测部分糖基化时不很准确。（2）利用内糖基化酶和内糖肽酶标记位点，然后用氨基酸序列分析法。用酶在N-连接位点留一个“标记”，通常使用内糖基化酶H（endo H）处理，随后用氨基酸检测仪分析，即可获得有关信息（3）糖蛋白用酶处理前后，用HPLC/FAN-MS检测分子量。此方法是先经过各种酶如胃蛋白酶/胰蛋白酶等作用，再用HPLC/FAN-MS来分离，获得肽段衍生物分子量，然后加以分析。

4.2糖蛋白上N-和O-寡糖链的释放

研究糖链结构，就要将糖链从糖蛋白上断裂下来，然后用各种色谱技术，如离子交换、HPLC、气相色谱等方法进行分离。目前主要的断裂方法有：（1）酶法：非还原的N-连接寡糖链可用PNGase和Endo H酶切，Endo H对于Manα1→3Manα1→6Manβ1→4（GlcNAc）2有特异性，只能切除高甘露糖和杂和糖链。PNGase F特异性较广，能切除大部分N-连接寡糖，但对于含有α1→3岩藻糖连接到GlcNAc的寡糖及糖肽的Asp有自由C-端或N-端的糖链无效。在大多数情况下，需将蛋白变性，这会造成糖链的不完整，尤其会失去唾液酸。（2）化学方法：此方法对释放糖链没有选择性，能够得到完整的寡糖链。例如，酰肼断裂N-连接寡糖、在温和的碱条件下断裂O-连接寡糖等。为了防止对碱敏感的键降解，需加入过量的还原剂，这就造成醇衍生物的产生。人们利用已知糖基化的蛋白对肼解方法研究发现，N-连接糖链都是完整的。

五、糖基化在不同异源蛋白表达系统中的差异

5.1细菌

此表达系统中最为常用的是大肠杆菌和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。由于易操作，获得量高，且基因背景、表达特性均很了解等因素，使得细菌表达系统成为最受欢迎的异源蛋白表达系统之一。虽然，最近发现如奈氏脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)等菌株中内源蛋白表面也有O-糖基化现象(结构不同于真核生物)，但是常用的细菌表达株均无糖基化能力。另外，已出现将几种关键性的糖基转移酶克隆进大肠杆菌中共表达，重新构建重组糖蛋白表面糖链结构的报道。此方面的研究工作有希望产生新型的重组糖蛋白异源表达体系。

5.2丝状真菌

大多数此类表达系统主要用于生产丝状真菌本身的内源性蛋白，如某些工业用途或可食用的酶类。虽然丝状真菌中许多蛋白质也能够糖基化，如丝状真菌分泌蛋白表面O-糖链大多连接一个Man，但是这一方面研究报道并不多。另外，由于其较低的转化效率，基因背景了解不充分，以及细胞外大量分泌蛋白酶的存在，使得异源蛋白的表达较为困难。

5.3酵母

用酵母表达和分泌外源蛋白，一个主要难点是其N型和O型糖基化作用机制不同于高等真核细胞。例如，酵母表达的人甲状旁腺素尽管有全部的生物活性，但其糖链修饰是酵母中特有的O-甘露糖基化方式。又如，人尿激酶-纤溶酶原激活物中EGF样结构域，在天然产物和哺乳动物细胞中表达为特殊的O-岩藻糖基化，而在啤酒酵母中表达无此现象。此外，酵母表达系统还可在蛋白糖链上添加α-l，3甘露糖基，井因此抗原表位而在人体内引起强烈的免疫反应。

酵母表达系统对外源蛋白可能存在过度糖基化修饰方式，以及缺乏复杂型糖链修饰，从而极大地影响了所表达糖蛋白的生物学功能。为了改造酵母的糖基化形式，现阶段主要采取二种措施：(1)位点专一性突变，

减少潜在的糖基化位点；(2)利用酵母的突变株，如外周糖链生物合成缺陷型和α-l，3甘露糖基转移菌缺陷型，产生类似哺乳动物的高甘露糖型糖链。例如，过度甘露糖基化是绝大多数酵母菌株共有的特征。而一个甘露糖合成途径的双突变株，mnn1mnn9，可表达非免疫原性、非过度糖基化的重组蛋白。然而，由于此类突变体生长缓慢，目前还不适于大规模工业化生产，故改造和发展这些菌株是今后的研究方向。

5.4转基因植物

利用外源基因导入植物表达系统，以植物作为“绿色工厂”生产药用蛋白的前景是十分诱人的。目前大多选用烟草和拟南芥菜作为植物表达系统的研究模型，而N—糖链又是植物表达系统中研究较为详细的。

在植物中，序列子Asn-X-Ser／Thr中Asn，与哺乳动物一样，是作为N-糖链接受体。但是,植物与哺乳动物在N-糖链的组成和结构上是不同的。植物的N-糖链仅包括高甘露糖型和复杂型,而无杂合型糖链。并且大多数植物的复杂型糖链仅含有Man、Fuc和Xyl，其连接方式也不同于哺乳动物，而与无脊椎动物十分相似。如植物复杂型糖链包括α1→3Fuc，哺乳动物中主要为αl→6Fuc；另外植物五糖核心结构上连→接了β1→2Xyl，而哺乳动物中无Xyl糖基修饰方式。植物所表达的糖蛋白在哺乳动物中有很高的免疫原性，可能与此二糖苷键结构有关。此外，哺乳动物细胞中存在着α-2，6唾液酸转移酶，而植物细胞无此酶，故其糖链结构上也无唾液酸成分。为了能够达到实际应用目的，避免产生高免疫原性的复杂型糖链结构，目前主要采取以下二种措施：(1)真核细胞中，蛋白质C端若带有滞留信号H／KDEL，将截留在内质网腔内。同样的，对植物中表达的重组蛋白进行改造(使之带有滞留信号序列)，能让其留在内质网中，避免进入高尔基体被植物系统糖基化；(2)利用基因工程技术，使植物高尔基体中糖基转移酶突变[knockout)或增添新酶，然后让糖蛋白最终贮存在如液泡或非原质体中。

5.5哺乳动物细胞

哺乳动物细胞株表达的重组产物，可带有复杂的糖链结构，和人源糖蛋白的糖链结构较为相似，故成为目前主要的异源糖蛋白表达系统。然而．哺乳动物细胞株在糖基化的机制上，与人类组织仍然有显著的差异。如，大多数哺乳动物细胞表达α1，3半乳糖基转移酶；而人类、类人猿中该酶基因已失活。故某些鼠源细胞株合成的末端Galα1，3-Gal糖链，在人体内可引起免疫反应。又如，成人的糖蛋白上不含乙醇酰唾液酸(NeuGc)，而在人.鼠杂交瘤细胞中含量则很高。不过幸运的是，CHO中不含上述二种糖基修饰方式，是一个较好的哺乳动物表达系统。

另一方面，糖蛋白上糖链功能一旦确定，糖基化突变株将是表达所需糖链结构的合适系统。同时，人们也希望通过突变株表达特定的剪切糖链，以发挥糖蛋白的最佳生物学活性。突变株还能产生不均一程度较低的糖蛋白，有利于重组糖蛋白的纯化、结晶和鉴定，也有助于糖蛋白的组织定位等。例如，Gaucher病是葡萄糖脑苷脂酶遗传性缺损性疾病，导致葡萄糖脑苷脂的堆积。其治疗药物葡萄糖脑苦脂酶从人胎盘中提取后，须用三个外切糖苷水解酶移去唾液酸、半乳糖和N-乙酰半乳糖，以便产生末端Man糖链，为网状内皮细胞所捕获。然而，更为简单的方法是利用lee1(CHO)细胞合成该重组糖蛋白来得到同样目的。并且此突变株产生的N-糖链为Man5GlcNAc2Asn，比外切糖苷酶处理产生的Man3G1cNAc2Asn，更能为网状内皮细胞表面的甘露糖受体所结合。哺乳动物细胞突变株，除了某些随基转移酶缺陷型突变株外，还包括外源糖基转移酶表达获得型突变株。

5.6转基因动物

用转基因动物表达重组药用蛋白，是一个新兴的生物工程领域。目前，至少有二个产品，转基因绵羊表达的人α1-抗胰蛋白酶和转基因山羊表达的抗凝血酶III，已进人I期临床试验。通常，转基因动物能产生非常类似于哺乳动物细胞系的糖链结构，但是其糖链结构仍随种属和器官的不同而不同，从而影响了糖基化的效率和专一性。比如，转基因鼠表达的γ-干扰素上Asn97糖链，主要为经剪切的寡聚甘露糖型结构。并且，将外源糖基转移酶基因导人转基因动物中共表达时，其分泌的乳汁中除含有所要表达的外源糖蛋白外，还含有大量游离的糖链结构成分。

六、蛋白药物开发

在过去的25年里，蛋白质研究领域发生了分子生物学、结构生物学、基因组学三次巨大的革命。而在未来的若干年中，微生物的基因图谱将保持每几个月获得一个的速度，由于将有更多基因的功能得到阐明，因

蛋白糖基化工程综述（实验室原创）

此在基因组时代，应该更多地关注功能研究。

通过蛋白质工程(即对蛋白质结构进行修饰以用于结构、功能和药物方面的研究)将糖基修饰到蛋白质和细胞表面技术，修饰上的低聚糖可使蛋白质结构产生巨大的多样性。许多内源性的人类蛋白质都是糖蛋白，细胞之间的识别和许多其它的体内功能都是由糖蛋白介导的。但要合成纯的糖蛋白很困难，因为在合成中糖基上的羟基需要得到保护，难以形成的、用于糖之间连接的糖苷链也必须构建，反应条件必须精心设计，以避免影响蛋白质和氨基酸侧链的保护基因，使得合成的糖蛋白尽可能具有与天然产物相似的结构和功能。为了以单个纯的糖蛋白而不是糖形来研究糖基在糖蛋白功能中的作用，最近研究人员已发明更为简单的糖蛋白合成的方法。新的合成方法中，以糖的模拟物来替代糖，并使用易于合成的肟和硫醚代替糖苷链连接糖分子。该方法反应选择性高，条件温和，不需要保护，明显减少了合成步骤，合成糖肽的速度也比常规方法快一个数量级。

在细胞表面的自然环境下构建起反应的糖蛋白的过程则称为反应性的低聚糖在细胞表面的代谢工程。该方法的思路是将含有能发生反应的官能团的非天然糖整合到细胞表面蛋白的聚糖部分中，然后利用引入的能发生反应的官能团作为进一步修饰的化学连接桥。例如在唾液酸糖蛋白研究中，研究人员将易发生反应的酮基连接到唾液酸前体上，产生N－乙酰基甘露糖胺。然后将它加入到培养液中，通过细胞代谢途径，它就作为唾液酸改造结构近日细胞表面的糖蛋白中，修饰上的酮基可作为选择性的、能起反应的官能团而用于进一步的糖蛋白改造，如以之连接所选择的胺氧糖(amionooxysugar)，则通过化学作用机理可重新限定这些细胞表面的糖结构类型。该技术是研究多种类型的细胞之间相互作用的有力工具，因为细胞表面的聚糖不仅与肿瘤细胞转移、内皮与白细胞的细胞相互作用和炎症响应有关，还与识别细菌和病毒的抗原决定基有关。然而，到目前为止，分子水平上的许多这种类型的相互作用仍不十分清楚，而这些糖基工程化的细胞将有助于更深入地了解这些细胞之间相互作用的特性。

当前，糖链结构分析的进步，已经使我们可以判断重组糖蛋白与天然产物之间糖链结构上的差异。而人们的最终目标是，重组糖蛋白的生产将超出简单重现天然糖蛋白糖形的目的；因为我们更希望改变特定的糖链结构，从而改进重组产物在体内的生物活性和代谢动力学等特性