猪蛔虫全基因组微卫星分子标记开发与特征分析

2023年12月17日发(作者：哈弗h8论坛)

Chinese

Journal

Veterinare

Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第9期

11猪蛔虫全基因组微卫星分子

标记开发与特征分析何晶晶黄建华牛红艳周春花吴小平（

大学生命科学学院，

330031），，，，摘要:为了从全基因组水平筛选猪蛔虫微卫星分子标记，通过PCR扩增和毛细管电泳技术进行基因分型。结果显示，

筛选获得了

25个能稳定扩增并具有多态性的微卫星位点。这些位点的等位基因数(NJ为2~25个，观测杂合度(H)和期

。望杂合度(He)分别为0

1和0.

042

0. 945，多态信息含量(PIC)为0.

040

-0. 921,其中20对显示中、高度多态性，无效等

位基因频率(F)和近交系数(Fb\"变化区间为0~0.

1和-0.

~1，显示杂合子缺失。25对微卫星分子标记中有15

对符合哈迪-温伯格平衡,10对或多或少的偏离平衡。且这些位点均能在人蛔虫中稳定扩增&本试验开发的微卫星标记可

为蛔虫的种群

学、流行病学、宿主

、

构、交配模式等研究提供有效的工具。关键词:猪

虫；全基因组；微卫星标记；多态性中图分类号：R532.

文献标志码：A

文章编号：0529—6005(2020)09—0011—04Development

and

Characterization

Genome-wide

Microsatellite

Markers

Ascaris

suumHE

Jing-jing

，HUANG

Jian-hua

，NIU

Hong-yan

，ZHOU

Chun-hua

，WU

Xiao-ping(School

Life

Sciencc

，Nanchang

University

，Nanchang

330031

，China)AbstracC:

The

purpose

this

study

was

develop

microsatellite

markers

for

Ascaris

suum

based

the

whole

genome.

Genoty?ping was

performed

PCR

amplification

and

capiCary

electrophoresis.

Twenty-five

microsatellite

loci

that

had

polymorphisms

and

re?sulted

stable

amplification

were

obtained.

The

number of

alleles per

locus

ranged

from

25-

The

observed

heterozyyosity (

H°)

and

expected

heterozyyosite

(

)

were

and

042

te 0.

945，respectively.

The

polymorphism

information

content

(

PIC

)

was

040

921，with

pairs

showing

higher

levels

polymorphisms.

The

frequency

null alleles (

and

inbred

coefficient

(

)

ranged

from

197

and

-0.

198

1，indicating

loss

heterozyyotes.

Among

the

pairs

microsatellite

molecular

mark-

as，fifteen

pairs

microsatellite

markers

conformed te

Hardy-Weinberg equiliCrium

(

HWE)，and

loci

showed

deviations

from

HWE.

These

loci

can

also

stably

amplified

lumbricoides.

These

newly

developed

mcrosatellite

markers

are

elective

tools

study

population

genetics，epidemiology，host

specificity，genetic

structure，and

mating

patterns

mmbricoides

and

words:

Ascaris

suum

；

genome-wide

；

microsatellite

markers

；

polymorphismsCorressonding

auttors:

ZHOU

Chun-hua

，

E-mail

zhouchunhuajx

hotmaii.

com

；

Xiao-ping

，

E-mail

xpwu

ncu.

edu.

cn猪蛔虫（Ascaris

suum

Goeza，1782年）隶属于线

虫

虫目，主要寄生于猪小肠，是生猪

的最畴微卫星标记又称短串联重复序列（Sicpla

tandem

repeat，STR），

分布于原核和真核生物基而成，

核昔记

，微.寄生虫

，

猪业

巨大的经

失同时猪蛔虫也可

，危害

健康此，

国家已将其

公

生学范收稿日期：2020—02—17基金项目：国家自然科学基金（81460318）组中，由1~6bp的重复单

重复最为

⑷。与其他分

分

记因其

信

、

显性、具有

、分布

、多的稳

和重复、于检测等优点，成为前

样性和

：构研究中的首选标记

[5]&但

前没有关于作者简介：

（2000

-），，本科生，就读于生物技术专业，E-mail

：260998934@qq.

com猪蛔虫的微

分

记相关信息的报导&虽然记研究猪蛔虫，但这些标记都虫而

通讯作者：周春花，E-mail：

zhouchunhuajx@

hotmaiC

com

；吴小

有学者应用微

于其

平，E-mail:

xpwu@

ncu.

edu.

cn[6_8]O

年来随着测 12

中国兽医杂志2020年（第56卷）第9期序技术的发展,从全基因组水平研究物种的微卫

星，一方面可以了解不同物种微卫星的生物信息学

特征，另一方面可以揭示微卫星在遗传多样性等领

域的应用（9w0）&因此,近年来基于全基因组开发微

卫星分子标记受到研究者青睐。猪蛔虫全基因组

测序已完成，其基因组微卫星分布规律也有报

道（11温2）&本试验基于已公布的猪蛔虫全基因组数

据，设计微卫星引物,验证其多态性，并进一步检测

其在近缘种人蛔虫中的扩增情况，以期为猪蛔虫和

人蛔虫的种群遗传研究、流行病学、宿主特异性、遗

传结构、交配模式提供有价值的研究工具和分子标

记资源&1材料与方法1.1

材料

猪蛔虫采自抚州市孝桥屠宰场，收集

了

25头猪的肠内容物，共198条猪蛔虫。1.

DNA提取和PCR扩增

取猪蛔虫样本，剪下

一小段体壁组织（约5

mm）用双蒸水洗去固定液

（2

次），剪碎，采用

Wizard?

Genomic

DNA

Purification

System试剂盒提取DNA&本试验猪蛔虫

全基因组序列从美国国家生物技术信息中心NCBI

（gww.

ncbi.

nlm.

nih.

gov/）下载，然后使用软

件MSDB

v2.

4.1搜索并统计微卫星序列，根据SSR

侧翼序列的保守性使用Priniar

Premier

0设计引

物，引物长度18~22

bp，GC含量在40%

~60%，目

的片段长度在100

-400

bp&总共设计了

104对猪

蛔虫微卫星引物，由生工生物工程（上海）股份有限

公司合成&利用上述104对引物进行PCR扩增，扩

增体系为

\"L:

Premia

Taq

Version

（

TaKaRa

）

\"L，上下游引物和DNA模板各2

\"L，MU3FAM

荧光标记引物1-6

\"L，加水至20

\"L&反应条件为

C预变性5

min，先进性5个循环的高温PCR：

C变性45

s,退火30

s，72

C延伸1

min,再进行

30个低温循环：94

C变性45

s,退火30

s,72

C延

伸1

min,最后72

C延伸7

min,4

C保存&用1%琼

脂糖凝胶电泳分离PCR反应产物。1.3

引物的筛选104对微卫星引物均先用6个

DNA样本扩增,能全部扩增出条带的引物即被初

选。然后将初选得到的引物用于猪蛔虫种群的扩

增（n

=30），琼脂糖凝胶电泳后，将有条带的扩增产

物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行STR

扫描。并将所有有多态性的引物用人蛔虫5

=6）

扩增&41-

数据处理根据扫描结果，利用CERVUS

V2.

计算等位基因数（Number

observed

0/1x0,

Chinese

Journal

Veterinara

MedicineNa

）、观测杂合度（Observed

heterozyyosity,

）

期

望杂合度（Expected

heterozyyosity,

HE）和多态信息

含量（Polymorphism

information

content,

PIC

）,利用

MicroLhecker

ver.

2.2.3计算无效等位基因频率

（Frequency

null

allelas,

F）

利用

Popgene1.

进

行近交系数（Inbreeding

coefficient,

）和哈迪-温伯

格平衡（Hardy-Weinberg

equilibrium,

HWE

）检测

&2结果2.1遗传多态性分析本试验基于猪蛔虫全基因

组，根据微卫星侧翼序列的保守性共设计了

104对

引物，经扩增筛选共获得38对能稳定扩增并具有清

晰条带的引物，经再次筛选后扩增成功的有28个位

点，初步测试显示所有位点也能在人蛔虫中扩增

（表中数据未显示）&在筛选到的28对引物中有25

对具有多态性（表1），扩增成功率26.9%

&在25个

有多态性的位点中，每个位点扩增得到的等位基因

数（Na\"在2~25个，平均&

2个;观测杂合度！Ho）

范围为0~1,平均值0.

442；期望杂合度（He）范围

为0.042

945,平均值0.602；多态信息含量

（PIC）范围为0.040

-0.

921,平均值0.558,其中有

15个微卫星位点显示高度多样性（PIC

>0.5）,5个

位点显示中度多态性（0.

PIC

>0.25

\"，其他位点

多态性较低！PIC

<0.25）（表1

）；无效等位基因频

率范围为

293

ASM46、ASM132、ASM213、

ASM252、ASM535、ASM551、ASM573、ASM597、

ASM598、ASM615、ASM632、ASM650

这

个位点没

有出现无效等位基因，其他位点均存在无效等位

基因&2.

哈迪-温伯格平衡检测

Hardy-Weinberg检测

显示，筛选获得的25个多态性位点中有15个符合

哈迪-温伯格平衡（P

>0.05）,有10个位点或多或

少偏离哈迪-温伯格平衡（图1

）&此外，通过Pop-

gene1.

32计算的Fp变化区间为-0.

198

1,其中

21个位点Fp

>0（图1）&3讨论HWE检测显示，多数位点偏离哈迪-温伯格平

衡。这与人蛔虫和Nirophorus

vespilloides开发的微

卫星分子标记类似［6，13］，同时乌干达西南部人蛔虫

的遗传多样性研究也出现了这种情况［14］,这很可能

是蛔虫种群的普遍现象&而造成这种结果的原因

可能是由于这些位点的纯合子过量或近亲繁殖，但

也可能是由于这些标记物中存在无效等位基因引

起的，此次试验也发现无效等位基因确实存在,而Chinese

Journat

Veterinara

Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第9期

13且无效等位基因存在的多数位点偏离HWE,其中

ASM7、ASM69、ASM118、ASM168

这

个位点显著偏

离HWE（

4%0.

001）,同时这

率

于其他位点

点无效等位基因。&由此推断无效等位的存在可能

偏离HWE的原

此外,Fl检测显示21个位点Fl〉0,且多数位

点观测杂合度小于期望杂合度,这

虫及其他虫

（6,15）,

为杂

缺失，种群个体

缘关

&试验结果

，

点杂

缺失,和/或Wahlund虫

这

可能是由宿主内个体

效应

。而Criscione等

样性分中

了杂

缺失的

图1猪蛔虫微卫星位点的Fs值统计Fig.

v;lue

microsatellith

loci

suum注:负值表示杂合子过剩，正值表示纯合子过量；点也偏离哈迪-伯格平衡，

这

效应，而

主内随机

可能是由于Wahlund⑹。综

所述,本试验的。为

点偏离哈迪-温伯格平衡可能是由无效和/或杂

缺失

:偏离哈迪-温伯格平衡的位点(*

：0-

<4%0.

；等

：0.001

<4%0.01

；

***：4%0.001)Note:

Nevative

values

indicate

heterozygous

excess.

Positive

indicate

本试验基于已公布的猪蛔虫

组,进行了分析，筛选的微猪蛔虫微

分记的

和

\"0X0770011/

excess.

Indicates

position deviating

from

Hardy-Weinbera

equilibrium

(

：0.

< 4%0.

；得了

25个能稳定扩

具有

：0. 001

<4%0.

；

***：4%0.001)点。这

记可用于蛔虫

构、

样性、遗传结和

杂交等的研究。表1猪蛔虫25个微卫星位点特征描述Tabla

Charocthrishcs

the

microsatellith

loci

for

suumss位点登录号GenBank

SSRlocus物序列(5

J3jPriNer

sequenca重复单元Repea?片段

大小/bpSize度/aAnnealing

temperature等位

基因数NA观测

杂HO期望

杂度HEnumbeomotif多态

无效等

信息

位基因

率含量PICFASM7ASM46MG786446F:AAAAGCAAAAACAGCAATGGG

GATGGCTAGAAGTGAGCACCG(TC)

n210

?2166030.0000.3580.3220.259

6MG786447F:

TGCGTTGAAGAGTGCGGTAT

GGGTTGGTGTTGTTTATGCGMG786448F:

TTCATAGTTCACACGCTCAA

TCTCAGGCATCACTTTTTCTMG786449F:

CAAGGAAAAAAGTTGAGGCA

AGCACTGACCGAGGTAGAGA(

CGA)

n196

?240267

-29758110.5420.6500.6200.057

8ASM69(

CT)

n4840.0420.4440.3710.274

0ASM97(

GAA)

n234

?3165850.2920.5460.4610.158

4ASM118MG786450F:

AGGAGGACACGGTAGAGCAA

AAGTAGAGCCAGTGGGAACG(

GA)

n193

?2676070. 1250.6050.5240.293

3F:

TTTCCCATCAGGTTTGTTTC

ASM119MG786451R:

TTGCCGTTTTCTTGACTTTCASM132(

GT)

n254

?2984740.3750.6890.6110.178

8MG786452F:

AAAATGTTGGAAACCAGGAA

ACCACCAGAAGCAGAGAGCAMG786453F:

ACTATGAACCATTGGCTTT53

TGTCGGGAACACTTGAACG(

TAAA)

n200

?2144920. 1250.2540.2180.099

4ASM168(

TTG)

n249

?2515020.0000.2840.2390.217

4ASM176MG786454F:

TCGGTTCAGGTTGGGATGGG

TCTCTCTTTGGGTGGGGGGC

CAAAAAGTGGTAGTAAATA-MG786455(

GA)

n357

?3675330.0420.0820.0790.036

1ASM209GTGCTGR:

ATTGGGAAGAGGGAGAAGG(GC)

n219

?39357110.5830.8240.7850.123 914

中国兽医杂志2020年（第56卷）第9期Chinese

Journal

Veterinara

Medicine续表1SS位点SSR

locus登录号GenBank

引物序列(5，\"3jPrimer

sequence重复单元

Repeat

motif(CA)

n片段

大小/bpSize282

?304退火温度/cAnnealing

emp%oaeuo%等位

基因数观测

杂合期望

杂度numbeoNa5Ho0.667He0.695多态

无效等

信息位基因

频率含量PIPFASM213MG786456F:

TGGCAGGTAAGCAACCGAAC

ggcaagtagagcatcccgaaF:

cttgaggaaaaatgagaacg

ACACACACGACACACAGACAF:

cccgatgttctgctgcta490.6200.008

3ASM252MG786457(GT)

n239

?2596090.8330.7100.6660.000

0ASM307MG786458R:

gctaaactgaatctcccctF:

CGCCGAACAATAAGTAGAT

(GA)

n174

24060100.5420.7720.7290.122

1ASM517MG786459R:

AATGTGAATAAGTGCCGAAF:

GTAGTATGGGCGGTGGGTAT(GA)

n392-4304990.6250.8460.8080.111

1ASM535MG786460R:

tctcacttcgtgcttccttgF:

TCCAACCCAAAGAGAACACG

AGAAAGCGGGGAAAAAAATCF:

ttgtttctatctgccctcgt

(GA)299

?3395250.4170.5820.4820.097

3ASM551MG786461(CT)218

?26248100.7920.8230.7810.007

7ASM555MG786462R:

gttttgttattttagcctcggtF:

atgttgtgatgaactgcga

(TG)325

-44755110.5420.8450.8060.156

3ASM573MG786463R:

cgataaaaaagtgtttgctgF:

atttttgggaggatgaacg

TCGGTAGAGTGGCAAGAGCF:

agattcaaccatcacacga

(AG)

n356

-3785920.0420.0420.0400.000

0ASM576MG786464(GTGA)331

-3755640.0830.1600.1530.063

8ASM597MG786465R:

tattctatgcccgaaaagtF:

ttagattcaaccatcacacg

ttcctatcattccagacaaaF:

TCATCTGGAGAGGTCAACGG

(GA)

n243

-34152250.9580.9450.9210.000

0ASM598MG786466(AG)

n340

-44060171.0000.9100.8830.000

0ASM615MG786467R:

CAACTAAGGCGGACAACGAGF:

ctctttttttgctttacctc(AT)

n224

-3004980.6360.8610.8000.102

0ASM632MG786468R:

tagtgccgcatcttgttaF:

aacattctgccacatttca

(TC)

n179

-31349180.8330.8880.8580.019

5ASM650MG786469R:

ctctctttctcctcgtcccF:

cgcttcaacgaaatccctct

(GA)

n195

-2076250.2920.3950.3630.068

3ASM666MG786470R:

ccacaaaatcaccttcctgc(TC)

n171

-30948140.3330.8460.8100.270

7F：正向引物；R：反向引物F:

Forward primes

；

Reverse

primesLetters

#2006

#9(5)

：615—629.参考文献：[1]

Peng

Zhou

Crompton

AscoWasis

Chino

(

Ad-

ranccs

parasitology,

1998

,41(41)

10^—148.[2]

Nejsum P,

Parkas E

D,Fodenbera

J,eg

al.

Ascariasis

zoonosis

Denmark

[

]

Journal

Clinical

Microbiology,

2005,43

(

[6]

Criscione

Andeoon

D,Raby

K,eg

Microsatellite

markers

for

the

human

nematode

parasite

Ascaris

lumbricoides:

development

and

assessment

utility

[

]

Journal

Parasitology,

2007,93

(3)

：704

—708.[7] 周春花#彭卫东?我国G2型人蛔虫和猪蛔虫的遗传多样性

[J]

?中国人兽共患病学报#2012,28(11)

：1093—1097.1142—1148.[3]

Peng

W,Criscionc C

AscaWasis

people

and

pies：New

infer?ences

from

DNA

analysis

rf worm

populations[

Infection

genet?ics and evolution,2012,12(2)

：47-55.[8

]

Zhou

Li M,

Yuan

Pie

ascaWs：

impoWant

sourer

ofhuman

ascariasis

China

[

]

Infection

Genetics

and

Evolution,

2012,12:1172—1177.[4]

Powell

Moraante

Andra

,et

al.

The

comparison

rf RFLP,

RAPD,

AFLP

and

SSR

(

microsatellite)

markers

for

gemiplasm

nalysis[

Momculas

Breeding,

1996

,2(3

)

：225-238.[5

]

Selkoe

A ,Toonen

Microsatellites

for

60010x181:0

practical[9]

Castaanone-Sereno

Danchic

Deleue

Genome?wide

suoex and

analysis

of microsatellites

nematodes,

with

fo?cus

the

plant-parasitic

species

Meloidop-yns

gTicopnita

[

]

Bmc

Genomics

,2010,11(1)

：

using

and

evaluating

microsatellite markers

[

]

Ecology(下转第19页)Chinese

Journal

of Veterinary

Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第9期

19增出2株完整的基因组序列，在ChPV基因组各片

ChPV的复制1[11]，从而未能成功分离出ChPV，后续

段的PCR扩增过程中,通过对退火温度进行优化,

最终确定片段1、2的最佳退火温度为55

a,片段3、4的最佳退火温度为60

a，片段5、6、7的最佳退

我们将采用其他方法进行病毒分离&本

究

供了

株

ChPV

的

组

列,

对来

不同地

的毒株进行

组

列同火温度为58

&和遗传进化分析&鉴于鸡群感染ChPV造成的经济

对来自不同地域的毒株进行基因组序列同源

损失,有必要对我国鸡群中ChPV的地理分布进行

广泛的流行病学研究&本研究可为ChPV诊断和流

行病学研究提供参考&参考文献：[1)

Zsak

Strother

Kisary

Pa/ial

genome

sequence

analysis

性和遗传进化分析发现，ChPV-SDWF株与ChPV-

HNPY

株核昔酸同源性最高，亲缘关系最近,其次与

美国TuPV参考株TuPV-260和匈牙利ChPV参考株

ChPV氟BU硫1核昔酸同源性较高，亲缘关系较近&

过对分

株

考株的

NS1

、

V41

和V2基因核昔酸和氨基酸的同源性分析发现,NS1

of parvevirusvs

associated

wik

ente/c

disease

poultr/[

J).

Avian

Pathology,2GG8,37(4)

：435—441.[2)

Guy

Virus

infections

gastrointestinal

tract

poultry基因较V4基因和V42基因具有较高的保守性，其

次是V41和V42基因&

ChPV-SDWF株与ChPV-

HNPY

株与美国TuPV参考株TuPV-260具有较高的

[J). Poultry

Sci/cv,1998,77(8)

：1166

—1175.[3)

Kapgatv

Kumanan

Vijayarani

Avian

parvevirus:

同源性和较近的亲缘关系，说明它们在某个时间从

一个共同的祖先分化开来⑸，也说明了不同毒株同

classification

phylogeny,

pathogenesis

and

diagnosis[

J).

Avian Pa?thology

,2618

：

—1G.[4)

奉彬，谢芝勋,张艳芳，等?鸡细小病毒半巢式PCR检测方法的

源性的高低以及亲缘关系的远近与不同毒株所处

的地域没有直接的关联&基于ChPV

V41基因构建

的遗传进化树同基于全基因组构建的遗传进化树

建立及初步应用[J)

?中国畜牧兽医,2617,44(5)

：1295—13G1.[5)

Day

Zsak

DeterminaVon

and

analysis

full-length

chicken

parvevirus

genome[

J).

Virology

,2G1G

,399(

：59-64.[6)

Zsak

L,Cha

RM,Li

Host

specificity

and

phylogenetic

rv-

的相似性好于基于NS1和VP2构建的遗传进化树

aationshipsoechicken

and

tuekeypaeeoeieuses

[

cAeian

Disea-

svs,2G15

,59(1)

：157—161.[7)

Koo B

Lav

Jeon

Genetic

characterization

theeenoeea3hiken

paeeoeieussteainsbased

anaaysisoetheie

（数据未提供），据此可推测可用V4基因来代替全

基因组构建遗传进化树&

VP2蛋白的三级结构表明

在蛋白外表面有4个Loop,内部有1个由8条反向

平行的#折叠形成的桶，与ChPV

ABU-L1基因组具

有类似的结构（12）&Nunez

LFN等［10〕曾采用卵黄囊接种的方法将

coding sequences

[

J) .Avian

Pathology,

2615

(1)

：28—34.[8)

Feng

B,Xie

Z,Deng

X,el

Genetic

and

phylogenetic

analysis

anoeeapaeeoeieusisoaated

eeom

3hikensin

Guangx

i,Ch

ina

[

猪蛔虫全基因组微卫星分子标记开发与特征分析

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