急性髓系白血病患者NPM1、FLT3和C

2023年11月24日发(作者：吉利熊猫2021款自动挡)

急性髓系白血病患者NPM1、FLT3和 C-KIT基因突变的

检测及其预后分析

李玲， 吕晓东， 米瑞华， 丁晶， 陈琳， 王倩， 尹青松， 胡杰英， 范瑞华，

魏旭东*

【摘 要】摘要 本研究旨在评估NPM1、FLT3和 C-KIT基因突变在急性髓系白

血病(AML)患者中的发生频率和对预后的影响，并探讨这些突变与临床特点、

细胞遗传学及生存情况的关系。对我院2010年8月至2012年10月收治的

78例初治AML患者，采用PCR扩增产物直接测序法或毛细管电泳法检测

NPM1、FLT3和 C-KIT基因的突变情况，了解这些突变阳性患者的临床特征。

结果显示，NPM1突变患者在AML中的发生率为14.1%，在正常核型AML

中的发生率为26.7%。NPM1基因突变者发病年龄偏高(P<0.05)，外周血白细

胞和血小板数高(P<0.05)，CD34低表达(P<0.05)，而在性别比例、骨髓原始

细胞比例、血红蛋白浓度、CD117和HLA-DR表达水平、完全缓解(CR)率、

总生存(OS)率、复发率方面差异无统计学意义(P>0.05)。78例AML患者中9

例(11.5%)FLT3-ITD突变阳性，3例FLT3-TKD(3.8%)突变阳性，无同一患者

同时发生这两种突变； FLT3-ITD突变者外周血白细胞和骨髓原始细胞比例较

高(P<0.05)，总生存率偏低(P<0.05)，多见于正常核型(P<0.05)，而在性别比

例、年龄、外周血血小板数、血红蛋白浓度、完全缓解率、复发率方面差异无

统计学意义(P>0.05)。FLT3-TKD突变例数较少，未单独进行统计学分析。6

例(7.7%)C-KIT突变阳性。C-KIT突变在异常核型AML中的发生率较高

(P<0.05)，复发率较高(P<0.05)，总生存率较低(P<0.05)，而在性别、年龄、

骨髓原始细胞比例、外周血象、完全缓解率方面差异无统计学意义(P>0.05)。

结论： NPM1、FLT3和C-KIT突变检测有利于指导AML患者的治疗及预后评

估。

【期刊名称】中国实验血液学杂志

【年(卷),期】2013(021)003

【总页数】6

【关键词】关键词 急性髓系白血病; NPM1突变; FLT3突变; C-KIT突变

【文献来源】

/academic-journal-cn_journal-experimental-

hematology_thesis/

·论著·

NPM1突变和FLT3-ITD突变都是成人AML最常见的基因突变(发生率分别为

30%和20%)，均倾向于发生在正常核型AML(NK-AML)患者(发生率分别可达

60%和35%)。正常核型伴单独NPM突变的AML预后较好,但当合并FLT3-

ITD突变时预后较差。伴FLT3-ITD突变的NK-AML有不良预后,被列为高危组。

FLT3-TKD突变对预后的影响尚不明确。伴t(8;21)或AML1-ETO基因阳性的

AML预后良好，但若有c-KIT突变则预后不良，属于中危组。鉴于NPM1、

FLT3和c-KIT基因突变对AML患者有重要的预后价值，以及为了进一步指导

AML患者的危险度分层和个体化治疗，本研究分析了本院78例初治AML患

者中这3种基因突变的发生情况及与其预后的关系。

材料和方法

研究对象

2010年8月至2012年10月在本院收治的初治AML患者78例，男40例，

女38例，中位年龄36(4-72)岁。其中M0 1例，M1 5例，M2a 31例，

M2b 16例, M3 3例，M4 9例，M5 10例，M6 2例，M7 1例。对所有初诊

患者均进行血常规、骨髓细胞形态学、流式细胞免疫分型、细胞遗传学、分子

生物学(如融合基因和基因突变等)检查明确诊断。诊断标准符合文献标准[1]。

染色体核型分析

抽取患者骨髓5-6 ml,肝素抗凝，细胞计数后按(1-2)×106/ml的细胞密度接种

到3个培养液中，进行短期培养，按常规制备染色体，经低渗、固定后收获细

胞，R显带、姬姆萨染色后进行核型分析。染色体核型异常按《人类细胞遗传

学国际命名体制》(ISCN2005)进行描述。剩余细胞悬液置-20℃保存备用。

白血病免疫分型

从每例初发患者取骨髓2 ml，行白血病免疫分型分析。单克隆抗体包括髓系相

关抗原：CD13、CD33、CD11b、CD117、CD64、cMPO、CD14、CD15和

CD41a；淋系相关抗原：CD2、CD3、cCD3、CD4、CD5、CD7、CD8、

CD10、CD19、CD22、cCD79a和CD20;非特异性抗原：HLA-DR、CD34、

CD38和CD56。

基因组DNA的制备

取患者初诊时冻存的骨髓单个核细胞1.0×107。采用DNA提取试剂盒(北京

TIANGEN公司产品)提取基因组DNA, 测定吸光度A260 nm/A280 nm值确

定DNA产物的浓度，用去离子水稀释基因组DNA样品至50-150 ng/μl。

PCR扩增

NPM1和FLT3-TKD基因扩增 PCR总体系20 μl,包括模板DNA 3 μl、dNTPs

0.4 mmol/L、正反义引物各0.4 mmol/L、TaqDNA聚合酶1 μl和所提供缓冲

液16 μl及Mg2+(上海源奇生物医药科技有限公司产品)。PCR条件： 42℃ 5

min；94℃ 5 min；(94℃ 30 s；62℃ 60 s)40个循环；72℃延伸5 min；产

物4℃保存。引物由上海源奇生物医药科技有限公司合成，如下： NPM1基因

(第12外显子):正义链:5′-ACCACATTTCTTTTTTTTTTTTTCCAGGCT-3′，反义

链：5′-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3′，扩增产物长度250 bp。

FLT3-TKD基因(第20外显子):正义链:5′-CCAGGAACGTGCTTGTCA -3′；反义

链：5′-TCAAAAATGCACCACAGTGAG-3′,扩增产物长度479 bp。扩增产物经

2%琼脂糖凝胶电泳(160 V, 25 min),EB染色后紫外光自动成像仪成像。

C-KIT和FLT3-ITD基因扩增 PCR总体系25 μl,包括模板DNA 3 μl、dNTPs

0.4 mmol/L、正反义引物各0.4 mmol/L、和所提供缓冲液22 μl及Mg2+(上

海源奇生物医药科技有限公司产品)。PCR条件：42℃ 5 min；94℃ 5 min；

(94℃ 15 s；60℃ 25 s；72℃ 1 min)40个循环；72℃延伸5 min；产物4℃

保存。引物由上海源奇生物医药科技有限公司合成，如下： C-KIT基因(第17

外显子):正义链: 5′-CAGCCAGAAATATCCTCCTTACT-3′,反义链：5′-

TGTCAAGCAGAGAATGGGTACTC-3′，扩增产物长度170 bp。FLT3-ITD基因

(第14和15外显子):正义链:5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′；反义链：

5′- CTTTCAGCATTTT GACGGCAACC-3′，扩增产物长度450 bp。扩增产物

经2%琼脂糖凝胶电泳(160 V, 25 min),EB染色后紫外光自动成像仪成像。

基因扩增产物序列分析

用测序部分检测试剂盒(上海源奇生物医药科技有限公司产品)对扩增良好的

PCR产物进行酶解、测序PCR、纯化。酶解PCR反应体系7 μl：PCR产物5

μl+2 μl SAP的混合物，混匀；PCR条件：37℃ 60 min；80℃ 15 min；产物

4℃保存。测序PCR反应体系6 μl: PCR酶解产物3 μl+ 测序试剂(bigdye )1

μl+ 测序引物2 μl；PCR条件：96℃ 1 min；(96℃ 10 s；50℃ 5 s；60℃ 4

min)25个循环； 产物4℃保存。测序产物采用标准的酒精/ EDTA/ NaAc法纯

化，用Applied Biosystems 3130测序仪(美国应用生物系统公司中国公司)通

过毛细管电泳对阳性PCR产物和测序引物进行测序，运用Chromas软件分析

测序结果，对NPM1和FLT3基因的阳性PCR产物行反向引物测序进行验证，

对C-KIT基因的阳性PCR产物行正向引物测序进行验证。分别检测NPM1基

因第12外显子基因的插入、FLT3-ITD基因第14和15外显子基因的插入、

FLT3-TKD基因第20外显子第835和836位氨基酸以及C-KIT基因第17外

显子第816位氨基酸的突变情况。

临床治疗方案

采用标准DA或HA方案进行诱导缓解，2个周期未达CR患者应用其他方案继

续诱导，CR的患者应用HDAC方案强化巩固治疗，综合情况进行自体或异基

因造血干细胞移植。

统计学处理

应用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。连续性变量资料采用Mann-

Whitney非参数检验。数据用中位数表示。分类资料采用卡方检验。采用

Kaplan-Meier法绘制生存曲线。生存率的比较采用Log-rank检验。以

P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

基因突变检测结果

NPM1、c-KIT、FLT3-TKD及FLT3-ITD基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结

果如图1。78例初诊AML患者中共检测出11例(14.1%)NPM1基因突变阳性

患者，FLT3-ITD突变阳性9例(11.5%)，FLT3-TKD突变阳性3例(3.8%)，无

同一患者同时发生这两种突变，其中同时发生NPM1和FLT3突变的阳性患者

为4例。c-KIT突变的发生率为7.7%(78例中6例)。

突变与细胞遗传学的关系

成功染色体核型分析73例，失败5例。30例正常核型AML患者中，8例

(26.7%)发生NPM1突变，与异常核型组(43例中3例，7.0%)相比，差异有统

计学意义(P<0.05)；7例(23.3%)发生FLT3-ITD突变，与异常核型组(43中2

例，4.7%)相比，差异有统计学意义(P<0.05)。c-KIT突变6例(4例t(8;21),2

例+8)全为异常核型，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

突变与其他一般临床参数的关系

11例NPM1突变阳性与67例突变阴性患者相比，以下指标差异有统计学意义：

发病年龄、WBC、Plt、免疫表型CD34阴性比例；而在以下指标方面差异无

统计学意义：性别比例、血红蛋白浓度、骨髓原始细胞比例、免疫表型中

CD117、HLA-DR表达水平(表2)。9例FLT3-ITD突变阳性与69例突变阴性

患者相比，以下指标差异有统计学意义：WBC、骨髓原始细胞比例；而在以下

指标方面差异无统计学意义：发病年龄、性别比例、Plt、血红蛋白浓度、免疫

表型中CD34、CD117、HLA-DR表达水平(表3)。6例c-KIT突变阳性与72

例突变阴性患者相比，以下指标差异有统计学意义：血红蛋白浓度；而在以下

指标方面差异无统计学意义：发病年龄、性别比例、WBC、Plt、骨髓原始细胞

比例、免疫表型中CD34、CD117、HLA-DR表达水平(表4)。

突变型与野生型的疗效比较

76例可评价疗效，其中NPM1突变型11例，NPM1野生型65例，两组≤2

个疗程CR率分别为72.7%和63.1%，两组复发率分别为18.2%和18.5%，差

异均无统计学意义(P>0.05)；FLT3-ITD突变型9例，FLT3-ITD野生型67例，

两组≤2个疗程CR率分别为33.3%和68.7%(P=0.08)，两组复发率分别为

44.4%和14.9%(P=0.09)，差异均无统计学意义；c-KIT突变型6例，C-KIT

野生型70例，两组≤2个疗程CR率分别为66.7%和64.3%，差异无统计学意

义(P>0.05)，两组复发率分别为66.7%和14.3%，差异有统计学意义

(P=0.009)。可评价疗效的76例患者中，NPM1突变型与野生型的总体生存率

差异无统计学意义(图2)；FLT3-ITD突变型与野生型及c-KIT突变型与野生型

的总体生存率差异均有统计学意义(图3和图4)。随访终点为2012年12月31

日或患者死亡时，中位随访时间10.3个月(1.5-66个月)。

讨 论

核磷蛋白1(NPM1)是一种多功能磷蛋白，主要位于核仁颗粒区，穿梭于细胞核

和胞浆之间，参与核质间物质转运。NPM1基因定位于人类5q35, 编码3种核

磷蛋白亚型：B23.1 (np_002511)、B23.2 (np_954654)和B23.3

(np_001032827)。主要功能有： ①作为伴侣蛋白和输出信号促进核糖体合成；

②通过调控中心体的复制维持基因组的稳定性； ③通过p53和p19ARF相互

作用调控细胞的增殖和凋亡。FLT3又称胎肝激酶2(FLK-2)或干细胞激酶

1(STK1), 表达于早期髓系/粒系祖细胞、胎盘、脑和性腺中，是Ⅲ型受体酪氨酸

激酶(RTK Ⅲ)家族成员之一。FLT3配体(FL)在造血干/祖细胞的增殖和分化过程

中起重要调节作用。C-kit基因也是RTK Ⅲ家族成员之一。C-kit配体为干细胞

因子(SCF),共同参与调控细胞增殖、分化和凋亡。

AML具有高度异质性，其发生发展和转归与细胞分子遗传学异常密切相关，其

中最常见的分子遗传学改变为NPM1、FLT3和C-KIT基因突变。Suzuki等[2]

报道，NPM1突变在初诊AML患者中的发生率为24.9%，在正常核型AML

中的发生率为47.4%。Thiede等[3]报道，NPM1突变在AML中的发生率为

27.5%，在正常核型中的发生率为45.7%。FLT3-ITD和TKD突变在初诊AML

中的发生率分别约为20.4%和7.7%[4]，且ITD突变者多表现为正常核型。C-

kit基因突变主要发生于核心结合因子AML(CBF-AML)患者，在AML-M2b中

的突变率高达48.1%[5]。本研究对78例AML患者研究发现，NPM1、FLT3-

ITD、TKD及C-KIT突变的发生率依次分别为14.1%、11.5%、3.8%和7.7%；

NPM1突变和FLT3-ITD突变都常见于正常核型AML患者(发生率分别为26.7%

和23.3%)，而c-KIT突变常见于异常核型，且在AML-M2b中的突变率为

25%，均低于国外报道；这种差异可能与样本例数少以及突变检测方法有关，

种族和地区差异所导致的患者亚型分布不同是否造成突变发生率差异也尚待进

一步研究。

NPM1突变在成人AML中的中位年龄偏高[6]，白细胞和血小板数目较高[8]，

并与CD34和CD117低表达相关，女性多见[7],但欧洲和美国比亚洲发生率高

[6]。Panagiotis等[9]认为，FLT3-ITD突变的AML患者外周血白细胞数和骨

髓原始细胞比例较高。本研究结果表明，NPM1突变的AML患者临床特点表

现为发病年龄偏高，外周血白细胞和血小板数高，CD34低表达；FLT3-ITD突

变者外周血白细胞数和骨髓原始细胞比例较高，均与国外文献的报道一致[6-9]。

但本研究也表明，NPM1突变在性别比例、CD117表达水平方面差异无统计

学意义，与国外报道不一致，需扩大样本量行进一步验证。

Schneider等[10]认为，NPM1突变提示预后良好。而Suzuki等[2]认为，

NPM1突变预示化疗后易达到CR，但却容易复发，故不影响CR率。

Panagiotis等[9]认为，FLT3-ITD突变的AML患者复发率增高，CR率和OS

都减低，FLT3-TKD突变对预后的影响目前尚存在争议。C-kit突变在伴t(8;21)

的AML中提示预后不良[11]。C-KIT突变极大地增加了复发的风险，可致缓解

期缩短，OS降低[12]。本研究显示，突变组与野生组相比，NPM1突变组CR

率较高，两组复发率和OS几乎相近；FLT3-ITD突变组CR率和OS都偏低，

复发率偏高；c-KIT突变组OS减低，复发率较高，两组CR率相近，与文献报

道基本相符[2，9-12]。若行大剂量化疗的大样本量深入研究，增加随访时间，

或许能对预后做出更准确的结论。

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J Exp Hematol 2013; 21(3):601-606

doi:10.7534/.1009-2137.2013.03.013

基金项目：国家自然科学基金(编号 81170520)；国家自然科学基金(编号

81000921)；卫生部科研基金(编号 2011010014)

*通讯作者：魏旭东, 主任医师、教授. 电话：. E-mail：

xdwei2000 @

2013-01-29 收稿；2013-03-04 接受

【文献来源】

/academic-journal-cn_journal-experimental-

hematology_thesis/