大别山红天麻饮片多指标质量标志物研究

2023年12月21日发(作者：最新2020款福特嘉年华)

　　·中药工业·大别山红天麻饮片多指标质量标志物研究，２?耿文洁１，汪聪聪１，刘劲松１，桂双英１，彭代银１，王举涛１△１?安徽中医药大学，安徽　合肥　２３００１２；２?中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽　合肥　２３００１２［摘要］　目的：对大别山红天麻饮片质量标志物进行研究，多指标成分评价测定其中９种质量标志物，推进红ＨＰＬＣ），以天麻素为内参物（ＺＳ），建立该成分与腺天麻质量标志物的相关研究进展。方法：采用高效液相色谱法（苷、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷Ａ、巴利森苷Ｂ、巴利森苷Ｃ、巴利森苷Ｅ的相对校正因子，采用相对校正因子计算各成分的质量分数，建立大别山产红天麻饮片的质量标准。结果：红天麻饮片质量标志物的９种成分均达到基线分离，线性关系均良好（ｒ?９９９５）；平均加样回收率为９６?８６％～１０２?２１％。相对校≥０正因子的ＲＳＤ均小于２％。并指认出其指纹图谱中１０种化学成分，建立大别山红天麻特征图谱。结论：一测多评ＱＡＭＳ）简便、准确、专属性强，选择的质量标志物科学合理，可用于大别山红天麻饮片多指标质量标志物的同步（测定，建立的含量测定方法可为红天麻的质量评价及控制提供参考。［关键词］　大别山红天麻饮片；中药质量标志物；一测多评；质量标准［中图分类号］　Ｒ２８４　　［文献标识码］　Ａ　　［文章编号］　１６７３?４８９０（２０２１）０３?０５２４?０６ｄｏｉ：１０?１３３１３／ｊ?ｉｓｓｎ?１６７３?４８９０?２０２００６０１００３ＳｔｕｄｙｏｎＭｕｌｔｉ?ｉｎｄｉｃａｔｏｒＱｕａｌｉｔｙＭａｒｋｅｒｓｏｆＲｅｄＧａｓｔｒｏｄｉａＤｅｃｏｃｔｉｏｎＰｉｅｃｅｓｉｎＴａ?ｐｉｅｈＭｏｕｎｔａｉｎ１１１１１１，２?ＧＥＮＧＷｅｎ?ｊｉｅ，ＷＡＮＧＣｏｎｇ?ｃｏｎｇ，ＬＩＵＪｉｎ?ｓｏｎｇ，ＧＵＩＳｈｕａｎｇ?ｙｉｎｇ，ＰＥＮＧＤａｉ?ｙｉｎ，ＷＡＮＧＪｕ?ｔａｏ１?ＡｎｈｕｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｆｅｉ２３００１２，Ｃｈｉｎａ；２?ＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲｅｓｅａｒｃｈ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｆｅｉ２３００１２，Ｃｈｉｎａ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｍａｒｋｅｒｓｏｆｒｅｄＧａｓｔｒｏｄｉａｄｅｃｏｃｔｉｏｎｐｉｅｃｅｓｉｎＴａ?ｐｉｅｈＭｏｕｎｔａｉｎ，ｅｖａｌｕａｔｅａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅ９ｑｕａｌｉｔｙｍａｒｋｅｒｓｉｎｍｕｌｔｉ?ｉｎｄｅｘｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｑｕａｌｉｔｙｍａｒｋｅｒｓｏｆＲｅｄＧ?ｅｌａｔａ?Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄ，ｗｉｔｈｇａｓｔｒｏｄｉｎａｓｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌ（ＺＳ），ａｎｄｔｈｉｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｗｉｔｈａｄｅｎｏｓｉｎｅ，ｐ?ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌａｌｃｏｈｏｌ，ｐ?ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ，ｐ?ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ，ｐａｒｉｓｏｎＡ，ｐａｒｉｓｏｎＢ，ｐａｒｉｓｏｎＣａｎｄｐａｒｉｓｏｎＥ?Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｃａｌｃｕｌａｔｅｔｈｅｍａｓｓｆｒａｃｔｉｏｎｏｆｅａｃｈｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ａｎｄｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒｔｈｅｒｅｄＧ?ｅｌａｔａｄｅｃｏｃｔｉｏｎｐｉｅｃｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｈｅＴａ?ｐｉｅｈＭｏｕｎｔａｉｎａｒｅａｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ?Ｒｅｓｕｌｔｓ：９ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｍａｒｋｅｒｓｏｆＲｅｄＧ?ｅｌａｔａｄｅｃｏｃｔｉｏｎｐｉｅｃｅｓａｌｌｒｅａｃｈｅｄｂａｓｅｌｉｎｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗａｓｇｏｏｄ（ｒ?９９９５）?Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｗａｓ９６?８６％ｔｏ１０２?２１％?ＴｈｅＲＳＤｖａｌｕｅｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅ≥０ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅａｌｌ＜２％?Ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ１０ｋｉｎｄｓｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｉｔｓｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ，ａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｍａｐｏｆＧ?ｅｌａｔａｉｎＴａ?ｐｉｅｈＭｏｕｎｔａｉｎ?Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｏｎｅ?ｔｅｓｔｍｕｌｔｉ?ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｉｓｓｉｍｐｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｑｕａｌｉｔｙｍａｒｋｅｒｓａｒｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄｒｅａｓｏｎａｂｌｅ?Ｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ?ｅｌａｔａｄｅｃｏｃｔｉｏｎｐｉｅｃｅｓ?Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉ?ｉｎｄｅｘｑｕａｌｉｔｙｍａｒｋｅｒｓｏｆＴａ?ｐｉｅｈｓｈａｎＲｅｄＧｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｐｒｏｖｉｄｅｓａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆＲｅｄＧ?ｅｌａｔａ?［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ＲｅｄＧａｓｔｒｏｄｉａｄｅｃｏｃｔｉｏｎｐｉｅｃｅｓｉｎＴａ?ｐｉｅｈＭｏｕｎｔａｉｎ；ｑｕａｌｉｔｙｍａｒｋｅｒｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ；ＱＡＭＳ；ｑｕａｌｉｔｙｓｔａｎｄａｒｄ天麻为兰科天麻属寄生植物天麻ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢｌ?的干燥块茎，是我国沿用已有一千多年历史的传△１］。天麻性统滋补名贵中药材之一，且可药食两用［平，味甘，归肝经，具有息风止痉、祛风通络、平［基金项目］　安徽省高等学校自然科学研究基金重点项目（ＫＪ２０１９Ａ０４６２）；安徽省中央引导地方科技发展专项ＹＤＺＸ２０１８３４００００４２３３）；安徽省科技重大专项（１８０３０８０１１２８）（［通信作者］　王举涛，教授，研究方向：中药质量研究；Ｅ?ｍａｉｌ：ｗｊｔ５９１＠１６３?ｃｏｍ?··５２４

　　抑肝阳等功效［２］，主要用于肝风内动、惊痫抽搐、眩晕、头痛及中风手足不遂、风湿痹痛等证。我国天麻可分为５种变型：红天麻、绿天麻、乌天麻、松天麻和黄天麻［３］。安徽大别山地区主产红天麻，其为天麻的原变型，具有很高的研究价值。质量标志物主要依据中药属性、制造过程及配伍理论等特点提出，是中药及中药复方质量评价的指标性成分［４?５］。以１～２种活性成分或指标成分进行定性定量分析的质量评价模式已经不能满足中药质量评价的要求，多指标综合质量评价模式已成为中药质量评价的新需求，也是新的研究趋势［６?８］。本研究通过一测多评（ＱＡＭＳ）研究大别山红天麻质量标志物及特征图谱，为其质量标准的建立提供参考。１　材料１?１　仪器ＤＺＦ?６０５０型真空干燥箱（上海博讯设备厂）；ＡＵＷ２２０Ｄ型分析天平、ＬＣ?１０ＡＤ型日本岛津高效液相色谱仪（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）；ＨＨ?６型数显恒温水浴锅（金坛市朗博仪器制造有限公司）；ＡｎｋｅＴＧＬ?１６Ｇ型离心机（上海安亭仪器科学仪器厂）；ＫＱ２２００型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ＴｈｅｒｍｏＵｌｔｉＭａｔｅ３０００型高效液相色谱仪；Ｗａｔｅｒｓ１５２５型高效液相色谱仪。１?２　试药对照品天麻素（批号：ＤＳＴ１８０４１１?０１３）、腺苷（批号：ＤＳＴ１８１１１０?０４７）、５?羟甲基糠醛（批号：ＤＳＴ１８０７０９?０５６）、对羟基苯甲醇（批号：ＤＳＴ１８１２１６?１２３）、对羟基苯甲醛（批号：ＤＳＴ１９０５１２?１２９）、巴利森苷Ａ（批号：ＤＳＴ１８０４１９?１０２）、巴利森苷Ｅ（批号：ＤＳＴ１９０２１４?０６６）纯度≥９８％；对照品巴利森苷Ｂ（批号：ＤＳＴ１９０２１４?０６３）、巴利森苷Ｃ（批号：ＤＳＴ１９０２１４?０６４）纯度≥９７％；对照品对羟基苯甲酸（批号：ＤＳＴ１８０５０６?１１４，纯度≥９９％），以上对照品均购自成都德斯特生物科技有限公司；乙腈、磷酸均为色谱纯；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。从大别山地区分别收集１０批红天麻饮片，经安徽中医药大学杨青山副教授鉴定为兰科天麻属植物天麻ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢｌ?的干燥块茎。留样均保存于安徽中医药大学天然药物化学实验室。样品信息见表１。表１　１０批红天麻饮片产地信息批号编号产地２０１８１２００１ＹＳ１安徽金寨县２０１８１２００２ＹＳ２安徽金寨县２０１８１２００３ＹＳ３安徽金寨县２０１８１２００４ＹＳ４安徽岳西县２０１８１２００５ＹＳ５安徽岳西县２０１８１２００６ＹＳ６安徽霍山县２０１８１２００７ＹＳ７安徽霍山县２０１８１２００８ＹＳ８湖北黄冈市２０１８１２００９ＹＳ９湖北黄冈市２０１８１２０１０ＹＳ１０湖北黄冈市２　方法与结果２?１　色谱条件色谱柱为ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌＧＯＬＤＣ１８（２５０ｍｍ×４?６ｍｍ，５μｍ）；流动相：乙腈（Ａ）?０?２％磷酸水溶液（Ｂ），梯度洗脱（０～２１ｍｉｎ，３％～５％Ａ；２１～４２ｍｉｎ，５％～１４％Ａ；４２～５６ｍｉｎ，１４％Ａ；５６～６０ｍｉｎ，１４％～２０％Ａ；６０～６５ｍｉｎ，２０％～３４％Ａ；６５～７８ｍｉｎ，３４％～９５％Ａ；７８～８３ｍｉｎ，９５％～３％Ａ；８３～９０ｍｉｎ，３％Ａ）；检测波长：２７０ｎｍ；柱温：３０℃；流速：１?０ｍＬ·ｍｉｎ－１；进样量：１０μＬ。理论塔板数按天麻素峰计算应不低于５０００。在此条件下，９种质量标志物与相邻色谱峰的分离度均大于１?５，见图１。

　　２?２　混合对照品溶液的制备精密称取腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷Ａ、巴利森苷Ｂ、巴利森苷Ｃ、巴利森苷Ｅ对照品各适量，加３０％乙腈，制成质量浓度分别为０?１２７０、０?１８０６、０?０１７５、０?００１５、０?０００９、０?２３８０、０?１３５０、０?０４７０、０?１１３２ｍｇ·ｍＬ－１的混合对照品溶液，摇匀，于冰箱中避光保存，备用，滤过，即得。２?３　供试品溶液的制备取红天麻饮片粉末（过三号筛）约０?４ｇ，精密称定，置５０ｍＬ圆底烧瓶中，精密加入３％乙腈２５ｍＬ，称定质量；置于８５℃的水浴锅中，回流０?５ｈ，放冷，补足减失的质量，０?２２μｍ微孔滤膜滤过，即得。２?４　方法学考察２?４?１　线性关系考察　精密吸取２?２项下混合对照品储备液２、４、６、８、１０、１２μＬ注入液相色谱仪。以各对照品的质量为横坐标，相应的峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，见表２。结果表明，９种质量标志物成分在相应范围内线性关系良好。表２　大别山红天麻饮片线性关系标准曲线成分回归方程线性范围／ｍｇｒ腺苷Ｙ＝０?７４１６Ｘ＋１?３２９５０?２５４０～１?５２４００?９９９５天麻素Ｙ＝０?３９５９Ｘ＋１?０５８８０?３６１２～２?１６７２０?９９９８对羟基苯甲醇Ｙ＝１０?７１１Ｘ＋０?００４１０?０３５０～０?２１０００?９９９７对羟基苯甲酸Ｙ＝６７?３６５Ｘ＋０?００２６０?００１８～０?０１０８０?９９９５对羟基苯甲醛Ｙ＝１０３?５７Ｘ＋０?００４６０?００３０～０?０１８００?９９９７巴利森苷ＡＹ＝０?６６０６Ｘ＋２?２３２４０?４７６０～２?８５６００?９９９６巴利森苷ＢＹ＝１?８４５７Ｘ－０?０４８２０?２７００～１?６２０００?９９９６巴利森苷ＣＹ＝０?８１５５Ｘ＋０?２８１９０?０９４０～０?５６４００?９９９８巴利森苷ＥＹ＝１?７９２５Ｘ－０?０３４１０?２２６４～１?３５８４０?９９９５２?４?２　精密度试验　精密吸取同一供试品（批号：２０１８１２００１Ｙ）溶液１０μＬ，按２?１项下色谱条件连续进样６次，记录各组分色谱峰面积。结果表明，腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷Ａ、巴利森苷Ｂ、巴利森苷Ｃ、巴利森苷Ｅ的峰面积ＲＳＤ分别为１?２６％、１?４４％、０?５９％、０?９１％、０?７３％、０?２２％、０?２１％、０?８３％、０?３５％，结果ＲＳＤ均小于２％，表明仪器的精密度较好。２?４?３　稳定性试验　取同一供试品（批号：·５２６·２０１８１２００１Ｙ）溶液，分别于制备后０、３、６、９、１２、２４ｈ进样１０μＬ，测得腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷Ａ、巴利森苷Ｂ、巴利森苷Ｃ、巴利森苷Ｅ峰面积的ＲＳＤ分别为１?２１％、１?５６％、０?５５％、１?０６％、１?０６％、０?２８％、０?３２％、０?５８％、０?２２％，结果ＲＳＤ均小于２％，说明供试品溶液在２４ｈ内稳定。２?４?４　重复性试验　精密称取同批次大别山红天麻饮片（批号：２０１８１２００１Ｙ）粉末（过三号筛）约０?４ｇ，按２?３项下供试品溶液的制备，平行制备６份，按２?１项下色谱条件进样测定。结果表明，腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷Ａ、巴利森苷Ｂ、巴利森苷Ｃ、巴利森苷Ｅ的质量分数ＲＳＤ分别为１?０５％、１?２３％、０?４６％、１?２９％、１?５４％、０?７３％、０?６８％、０?４８％、０?５８％，结果ＲＳＤ均小于２％，表明重复性良好。２?４?５　加样回收率试验　精密称取已测定的大别山红天麻饮片粉末（过三号筛）约０?２ｇ，加入一定量的混合对照品溶液，平行制备６份，按２?１项下色谱条件进样测定。结果表明，腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷Ａ、巴利森苷Ｂ、巴利森苷Ｃ、巴利森苷Ｅ的平均加样回收率分别为９８?３３％、１０１?８５％、１０１?０６％、９８?５９％、９７?４６％、９６?８６％、１００?７４％、１０２?２１％、９９?０２％，ＲＳＤ分别为１?５７％、１?１０％、１?４９％、１?６７％、１?５４％、１?３１％、１?４９％、１?２３％、１?６１％。２?５　ＱＡＭＳ含量测定２?５?１　相对校正因子的计算　以天麻素为内标，按公式（１）计算其他８种成分的相对校正因子，结果见表３。ｆｋ／ｍ＝ｆｋ／ｆｍ＝（Ｃｋ×Ａｍ）／（Ｃｍ／Ａｋ）（１）式中ｆ代表相对校正因子，ｋ代表内标物，ｍ代表其他组分，Ｃｋ为内标物质量浓度，Ａｋ为内标物峰面积，Ｃｍ为其他组分的质量浓度，Ａｍ为其他组分的峰面积。２?５?２　相对校正因子的耐用性考察２?５?２?１　不同仪器对ｆ的影响　考察Ｗａｔｅｒｓ、Ｔｈｅｒｍｏ、岛津３个品牌的高效液相色谱仪对ｆ的影响，结果见表４。２?５?２?２　不同色谱柱对ｆ的影响　考察Ａｇｉｌｅｎｔ５ＴＣ?Ｃ１８（２）（２５０ｍｍ×４?６ｍｍ，５μｍ）、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＧｅｍｉｎｉＣ１８（２５０ｍｍ×４?６ｍｍ，５μｍ）、ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ

　　表３　腺苷等８种成分相对校正因子进样量Ｌ２μＬ４μＬ６μ８μＬ１０μＬ平均值ＲＳＤ／％腺苷１?７９５４１?７８６７１?７７５２１?７６６３１?７８３１１?７８１３０?４７对羟基苯甲醇０?６７８１０?６７５６０?６７８６０?６６３６０?６８２００?６７５６０?７１对羟基苯甲酸０?９２８４０?９３９２０?９２２２０?９２５２０?９１５３０?９２６１０?６７对羟基苯甲醛０?８６３００?８７７６０?８８７３０?８８９４０?８８１００?８７９７０?８５巴利森苷Ａ１?２９５１１?２８６２１?２６９３１?２７６９１?２８９１１?２８３３０?６４巴利森苷Ｂ１?４２０６１?４２３９１?４２４６１?４１５１１?４３６２１?４２４１０?３６巴利森苷Ｃ１?４０５６１?３９２３１?３８７８１?３７３０１?４０２８１?３９２３０?６８巴利森苷Ｅ１?５５３０１?５４０４１?５１６１１?５４７２１?５２６１１?５３６６０?８０表４　不同仪器对红天麻饮片中８种成分相对校正因子的影响色谱仪Ｗａｔｅｒｓ１５２５Ｔｈｅｒｍｏ３０００岛津ＬＣ?１０Ａ平均值ＲＳＤ／％腺苷１?８４８９１?７９２３１?７８８８１?８１００１?４３对羟基苯甲醇０?６９９８０?６７９３０?６７２３０?６８３８１?５６对羟基苯甲酸０?９５２３０?９２４８０?９１９８０?９３２３１?４３对羟基苯甲醛０?８９５２０?８７３４０?８６４１０?８７７６１?３４巴利森苷Ａ１?３０３４１?２８４８１?２５８６１?２８２３１?２３巴利森苷Ｂ１?４６８２１?４２５７１?４１７５１?４３７１１?４４巴利森苷Ｃ１?４２７３１?３９７６１?３８５６１?４０３５１?１３巴利森苷Ｅ１?５８４６１?５３７５１?５２９５１?５５０５１?４６ＧＯＬＤＣ（２５０ｍｍ×４?６ｍｍ，５μｍ）３种色谱柱对ｆ１８的影响，结果见表５。结果表明，ｆ对不同品牌色谱柱具有良好的适应性。２?５?３　１０批次样品含量测定结果　取１０批大别山区产红天麻样品，按照２?３项下方法制备供试品溶?１项下色谱条件进样分析，测定其９种液，按照２质量标志物成分的含量，结果见表６。１０批样品中各－１２?３４７～２６?５５７ｍｇ·ｇ、天成分质量分数分别为腺苷２－１麻素８?０８０～１０?３２０ｍｇ·ｇ、对羟基苯甲醇４?６２９～－１－１８?３０１ｍｇ·ｇ、对羟基苯甲酸０?６３８～１?６２７ｍｇ·ｇ、－１对羟基苯甲醛３?２９８～６?６３３ｍｇ·ｇ、巴利森苷Ｅ－１１３?５９４～１９?９０５ｍｇ·ｇ、巴利森苷Ｂ１８?０２９～－１－１·ｇ、巴利森苷Ｃ４?９４２～６?９２１ｍｇ·ｇ、２４?４８０ｍｇ－１巴利森苷Ａ２５?９３９～３１?１４７ｍｇ·ｇ。表５　不同色谱柱对红天麻饮片中８种成分相对校正因子的影响色谱柱Ａｇｉｌｅｎｔ５ＴＣＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＴｈｅｒｍｏ平均值ＲＳＤ／％腺苷１?７５７６１?８２１９１?７９２７１?７９０７１?２３对羟基苯甲醇０?６７２６０?６９４８０?６８９６０?６８５７１?２７对羟基苯甲酸０?９０４４０?９３１４０?９３２８０?９２２９１?３３对羟基苯甲醛０?８９３４０?８４９８０?８６８２０?８７０５１?７６巴利森苷Ａ１?２５５８１?２３４４１?２８３１１?２５７８１?３４巴利森苷Ｂ１?４３４１１?３９４３１?４４１２１?４２３２１?３５巴利森苷Ｃ１?３９７８１?３６７８１?４１２３１?３９２６１?１９巴利森苷Ｅ１?５４７８１?４８９７１?５５２７１?５３０１１?７６表６　１０批红天麻饮片样品中９种质量标志物含量测定结果（ｎ＝３）－１ｍｇ·ｇ批号２０１８１２００１Ｙ２０１８１２００２Ｙ２０１８１２００３Ｙ２０１８１２００４Ｙ２０１８１２００５Ｙ２０１８１２００６Ｙ２０１８１２００７Ｙ２０１８１２００８Ｙ２０１８１２００９Ｙ２０１８１２０１０Ｙ质量分数腺苷２２?９９９２６?５５７２５?４２７２３?７５６２２?３４７２３?８４５２３?９１１２４?１６５２２?４９０２３?８４５天麻素９?９７３１０?２７１９?８１８８?９９２９?４０２９?７４３１０?３２０９?２２２８?０８０８?４２１对羟基苯甲醇５?９５１６?１６０６?２０７４?８４７６?３３６６?７００８?３０１５?２５７４?９６４４?６２９对羟基苯甲酸０?７２９０?８４１１?６２７１?５８００?６７４０?７０１０?６３８０?６８４０?６５２０?７８２对羟基苯甲醛３?２９８５?７０１４?７８９４?６２４５?９６６６?６３３６?４４２５?４０５４?９０３６?０２７巴利森苷Ｅ巴利森苷Ｂ巴利森苷Ｃ巴利森苷Ａ１７?４５５１９?９０５１９?０３８１６?５０６１６?２００１７?３１７１８?４８０１５?２７６１３?５９４９１６１６?１８?７９７２１?１２８２０?２９２１８?０２９２１?１９９２２?１２９２４?４５４２４?４８０２２?１３１１８?２９４４?９４２６?０８０６?０６３６?７５７５?７７９６?２３０５?９３６６?９２１５?７５１６?７０５２７?７６９２６?３６１３１?１４７２９?１８１２５?９３９２７?８９８３０?４７９３０?５６６２７?７９７３０?２００·５２７·

　　２?６　特征图谱２?６?１　共有峰的确定　分别取１０批大别山红天麻样品，按照２?３项下方法制备供试品溶液，按照２?１项下色谱条件测定，生成大别山红天麻全谱峰匹配图，经与对照品比对，指认了１０个共有峰，１号峰（４?３４ｍｉｎ）为腺苷，２号峰（７?６３ｍｉｎ）为天麻素，３号峰（９?９６７ｍｉｎ）为５?羟甲基糠醛，４号峰（１２?６２ｍｉｎ）为对羟基苯甲醇，５号峰（２３?２５ｍｉｎ）为对羟基苯甲酸，６号峰（３０?７５ｍｉｎ）为对羟基苯甲醛，７号峰（３１?９６ｍｉｎ）为巴利森苷Ｅ，８号峰（４４?５２ｍｉｎ）为巴利森苷Ｂ，９号峰（４７?４５ｍｉｎ）为巴利森苷Ｃ，１０号峰（６０?３９ｍｉｎ）为巴利森苷Ａ。各共有峰相对保留时间的ＲＳＤ均小于２％，相对峰面积ＲＳＤ存在一定的差异。２?６?２　特征图谱相似度评价　取１０批大别山红天麻样品，按２?３项下方法制备样品溶液，并按２?１项下色谱条件依次进样测定。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（２００４Ａ版）”进行指纹图谱分析，采用多点校正后进行自动匹配（时间窗为０?１ｍｉｎ），用中位数法生成指纹图谱，结果见图２～３。１０批大别山红天麻样品色谱图与对照图谱相似度分别为０?９９９、０?９８９、０?９９９、０?９９２、０?９９５、０?９８８、０?９８８、０?９８９、０?９９３、０?９９９。图２　１０批大别山红天麻特征图谱匹配图注：１?腺苷；２?天麻素；３?５?羟甲基糠醛；４?对羟基苯甲醇；５?对羟基苯甲酸；６?对羟基苯甲醛；７?巴利森苷Ｅ；８?巴利森苷Ｂ；９?巴利森苷Ｃ；１０?巴利森苷Ａ。图３　大别山红天麻特征图谱合成对照图·５２８·３　讨论３?１　提取方式考察分别用甲醇、乙醇、５０％甲醇、５０％乙醇、３％乙腈超声处理，结果表明，使用流动相３％乙腈直接超声处理提取效率最高，故选择３％乙腈作为提取溶剂。对比用流动相３％乙腈回流和超声提取的样品，确立加热回流作为其提取方式，特征峰信息丰富。３?２　色谱条件选择采用ＤＡＤ检测器在１９０～４００ｎｍ对混合对照品溶液进行扫描，结果９个成分在２７０ｎｍ处均有较大吸收，确定测定波长为２７０ｎｍ。再分别对甲醇?０?１％甲酸溶液、甲醇?０?２％甲酸溶液、乙腈?０?１％磷酸溶液、乙腈?０?２％磷酸溶液的流动相体系进行考察，结果显示，乙腈?０?２％磷酸溶液系统色谱峰响应最好、分离度高、基线平稳，故最终确定流动相为乙腈?０?２％磷酸溶液。同时，还对流速、柱温进行了考察，分别考察了柱温２０、２５、３０、３５℃，以及流速０?８、１?０、１?２ｍＬ·ｍｉｎ－１下的分离效果，结果显示，在柱温３０℃、流速１?０ｍＬ·ｍｉｎ－１条件下色谱峰分离效果最优，故选择在此条件下进行实验。４　展望本研究建立天麻素与对羟基苯甲醇类及巴利森苷类成分等多指标质量标志物评价模式，选用性质稳定、价格低廉的天麻素为内标物，建立大别山红天麻中９个质量标志物的ＱＡＭＳ，同时建立了特征图谱，指认了其中１０个色谱峰，为今后大别山红天麻的质量控制提供参考。实验过程中发现，天麻素与对羟基苯甲醇类及巴利森苷类成分有相互转化的趋势，有待进一步实验研究。参考文献［１］　安中原，钟斌．天麻的化学成分与药理活性研究概况［Ｊ］．海峡药学，２０１７，２９（６）：２２?２４．［２］　唐德才，吴庆光．中药学［Ｍ］．３版．北京：人民卫生出版社，２０１６：２９５?２９６．［３］　李云，王志伟，刘大会，等．ＨＰＬＣ法测定鲜天麻中多指标成分的含量［Ｊ］．山东科学，２０１７，３０（２）：７?１２．（下转第５５４页）

　　Ｐｌａｎｔａ，２０１２，２３５（６）：１１８５?１１９５．３３３２．［４８］　ＳＲＩＶＩＤＹＡＮ，ＤＡＶＩＳＥＭ，ＣＲＯＴＥＡＵＲＢ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆ（４Ｓ）?ｌｉｍｏｎｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｍｕｔａｎｔｓｒｅｖｅａｌｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆｃａｔａｌｙｔｉｃｏｕｔｃｏｍｅｉｎａｍｏｄｅｌ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，２０１５，１１２ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ（１１）：３３３２?３３３７．［４９］　ＣＲＯＴＥＡＵＲＢ，ＤＡＶＩＳＥＭ，ＲＩＮＧＥＲＫＬ，ｅｔａｌ．（－）?Ｍｅｎｔｈｏｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，２００５，９２（１２）：５６２?５７７．［５０］　ＴＵＲＮＥＲＧ，ＧＥＲＳＨＥＮＺＯＮＪ，ＮＩＥＬＳＯＮＥＥ，ｅｔａｌ．，ｔｈｅｅｎｚｙｍｅｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒＬｉｍｏｎｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｐｅｐｐｅｒｍｉｎｔ，ｉｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｔｏｌｅｕｃｏｐｌａｓｔｓｏｆｏｉｌｇｌａｎｄｓｅｃｒｅｔｏｒｙｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９９９，１２０（３）：８７９?８８６．［５１］　ＭＡＨＭＯＵＤＳＳ，ＷＩＬＬＩＡＭＳＭ，ＣＲＯＴＥＡＵＲ．Ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｍｏｎｅｎｅ?３?ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｉｎｐｅｐｐｅｒｍｉｎｔ［Ｊ］．ｐｒｏｍｏｔｅｓａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｉｍｏｎｅｎｅｉｎｔｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，６５（５）：５４７?５５４．［５２］　ＭＣＣＯＮＫＥＹＭＥ，ＧＥＲＳＨＥＮＺＯＮＪ，ＣＲＯＴＥＡＵＲＢ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｔｈｅｇｌａｎｄｕｌａｒｔｒｉｃｈｏｍｅｓｏｆｐｅｐｐｅｒｍｉｎｔ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２０００，１２２（１）：２１５?２２４．［５３］　ＣＨＡＭＰＡＧＮＥＡ，ＢＯＵＴＲＹＭ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｎａｐｓｈｏｔｏｆｓｐｅａｒｍｉｎｔ（ＭｅｎｔｈａｓｐｉｃａｔａＬ．）ｌｅａｆｔｒｉｃｈｏｍｅｓ：Ａｇｅｎｕｉｎｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１３，１３（２２）：３３２７?ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｆａｃｔｏｒｙ［５４］　ＪＩＮＪＪ，ＰＡＮＩＣＫＥＲＤ，ＷＡＮＧＱ，ｅｔａｌ．ＮｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｕｎｒａｖｅｌｓｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆＳｐｅａｒｍｉｎｔ（Ｍｅｎｔｈａｓｐｉｃａｔａ）ｐｅｌｔａｔｅｇｌａｎｄｕｌａｒｔｒｉｃｈｏｍｅｓｔｈｒｏｕｇｈ［Ｊ］．ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌ，２０１４，１４ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ（１）：１?１５．［５５］　蒋征，王红，张小龙，等．裂叶荆芥花穗腺鳞代谢规律研Ｊ］．植物科学学报，２０１６，３４（２）：２９９?３０７．究［［５６］　ＭＡＲＫＳＭＤ，ＢＥＴＡＮＣＵＲＬ，ＧＩＬＤＩＮＧＥ，ｅｔａｌ．ＡｎｅｗｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｎｇｌａｒｇｅｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆＡｆｏｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ，ｃｅｌｌｗａｌｌａｎｄｏｔｈｅｒｔｙｐｅｓｏｆｔｒｉｃｈｏｍｅｓａｎａｌｙｓｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪ，２００８，５６（３）：４８３?４９２．［５７］　ＴＯＺＩＮＬ，ＳＩＬＶＡＳ，ＲＯＤＲＩＧＵＥＳＴＭ．Ｎｏｎ?ｇｌａｎｄｕｌａｒｔｒｉｃｈｏｍｅｓｉｎＬａｍｉａｃｅａｅａｎｄＶｅｒｂｅｎａｃｅａｅｓｐｅｃｉｅｓ：Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｍｏｒｅ［Ｊ］．ＮＺＪＢｏｔ，２０１６，５４（４）：４４６?ｔｈａｎｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ４５７．［５８］　ＪＵＤＤＲ，ＢＡＧＬＥＹＭＣ，ＬＩＭＺ，ｅｔａｌ．Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｒｔｅｍｉｓｉａｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｎｏｎ?ｇｌａｎｄｕｌａｒｔｒｉｃｈｏｍｅｃｅｌｌｓｏｆＡａｎｎｕａ［Ｊ］．ＭｏｌＰｌａｎｔ，２０１９，１２（５）：７０４?７１４．［５９］　植汉成，郭宝林，葛菲，等．非腺毛形态在（药用）植物分Ｊ］．中国现代中类和植物类药材鉴别方面的研究进展［药，２０１８，２０（４）：４８９?４９４．［６０］　蒋征，王红，吴