G蛋白偶联受体56参与轴突发育和髓鞘化-6页文档资料

2023年12月3日发(作者：杭州奥迪4s店电话)

G蛋白偶联受体56参与轴突发育和髓鞘化

DOI：10.3760/.1671-0282.2014.06.011 基金项目：国家自然科学基金（81271329）

通信作者：方明，Email： wellfm@163

Effect of GPR56 on axonal development and myelinationDeng Yiyu，

Zhou Gaofeng， Zeng Hongke， Zeng Wenxin， Jiang Wenxin， Fang Ming.

Emergency and Critical Care Department， Guangdong General Hospital

（Guangdong Academy of Medical Sciences）， Guangzhou 510080， China

Corresponding author： Fang Ming， Email： wellfm@163

轴突的髓鞘是成熟少突胶质细胞突起缠绕轴突形成的多层脂质结构，是神经元轴突与少突胶质细胞突起相互作用的结果[1-2]。大量的信号分子参与了这一复杂的相互作用。此过程包括3个方面：OLs增殖分化成熟；神经元轴突发育；成熟OLs向目标轴突的迁移、OLs突起黏附到神经元轴突上和OLs突起缠绕轴突形成髓鞘[3-4]。其中神经元轴突的正常发育在完成轴突髓鞘化起着关键的作用。有研究表明神经元轴突的电信号可以诱导少突胶质前体细胞的生存和增殖，可以增加少突胶质细胞内髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein， MBP）基因的表达[5]。因此神经元轴突的正常发育是完成轴突髓鞘化的必要条件。

大量分子会影响神经元轴突的发育。GPR56属于黏附性G蛋白偶联受体家族。既往报道表明：人GPR56基因发生R38Q、R38W、Y88C、C91S、C346S、W349S、R565W、L640R突变会导致双侧大脑皮层多小脑沟回畸形和白质发育缺陷[6-8]。GPR56基因突变所致白质的萎缩、局灶MRI-T2强信号类似第 1 页 于多发性硬化的病理改变[9]，提示GPR56分子可能参与了脑白质的发育和轴突髓鞘化。为了证实GPR56蛋白分子是否参与神经元轴突的发育和髓鞘化，本研究利用Gpr56基因敲除（Gpr56-/-）的小鼠，用免疫组化和Western blot观察髓鞘蛋白脂质蛋白（proteolipid protein， PLP）、轴突发育相关神经纤维丝蛋白（Neurofilament-200， NF-200）在成年Gpr56-/-小鼠胼胝体中表达。通过体外神经元培养观察Gpr56+/-和Gpr56-/-神经元轴突生长情况，比较两种神经元轴突的长度。用电镜观察成年Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体内轴突直径的大小和髓鞘化情况。通过上述系列实验研究证实GPR56分子是否参与了神经元轴突发育和髓鞘化。

1 材料与方法

1.1 材料

Gpr56基因敲除小鼠从美国哈弗大学医学院附属波士顿儿童医院Piao

xianhua博士实验室赠获。Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠在暨南大学医学院实验动物中心饲养，实验条件下自然饮食。购买商业化抗体：鼠抗NF-200（Sigma-Aldrich， Saint Louis， MO， USA， .N0142）、羊抗PLP

（Santa Cruz，Santacruz， CA， USA， -23570）、鼠抗Tuj1（Santa Cruz，Santacruz， CA， USA， -58888）、鼠抗β-actin

（Sigma-Aldrich， Saint Louis， MO， USA， .A1978）。

1.2 方法

1.2.1 实验设计方法 将出生后小鼠进行基因分型，分为Gpr56+/-组和Gpr56-/-组。每组32只。每组根据小鼠出生后时间分为出生后7 d、第 2 页 14 d、21 d、28 d（P7 d、P14 d、P21 d、P28 d） 4个亚组。每组在出生后P14 d、P21 d和P28 d各取3只小鼠进行灌流固定后行免疫荧光组织化学染色；取5只小鼠取新鲜的胼胝体进行Western免疫印迹实验；在出生后P28 d各取3只小鼠进行电镜检测。

1.2.2 神经元培养及神经元轴突生长观察、长度测量 将新生1 d小鼠进行genotyping后分为Gpr56+/-和Gpr56-/-组，分别进行神经元培养。将小鼠断头，分离鼠脑，置于PBS中，剥去血管脑膜，分离皮质，剪碎。胰酶消化15 min后吹散，筛网过滤。800 r/min离心2 min后弃上清，细胞沉淀用DMEM培养基悬浮，计数细胞密度。以0.75×105个/孔的密度接种在用多聚赖氨酸包被好的24孔板中。培养至24 h后用PBS快速洗3次，随后向24孔板中加入4%多聚甲醛室温下固定1 h。再用PBS洗3次，10 min/次，用Tuj1抗体4 ℃孵育过夜后，PBS清洗3次，每次10 min，滴加带绿色荧光的二抗工作液（goat anti-mouse IgG-FITC， Santa Cruz，Santacruz， CA， USA， -2010）室温下孵育1 h。PBS清洗三遍，用DAPI染核，再用mounting medium封片。在40倍物镜荧光显微镜下随机挑选30个视野进行拍照，每个视野至少有5个神经元。应用Image

J software （SummaSketch Ⅲ Summagraphics， Seattle， WA）测量每个神经元轴突的长度。

1.2.3 免疫组织化学染色 每组动物灌流、固定后移入30%蔗糖溶液过夜。冰冻切片机-20 ℃低温取视交叉水平冠状切片，片厚20 μm。正常工作血清封闭。与Western免疫印迹中同一来源的PLP（1∶200）、NF-200（1∶200）一抗4 ℃孵育过夜后，PBS清洗3次，每次10 min，滴加带红第 3 页 色荧光或带绿色荧光的二抗工作液室温下孵育1 h。PBS清洗三遍后用mounting medium封片。在荧光显微镜（Olympus System Microscope Model

BX53）下观察实验结果。

1.2.4 Western blot印迹 新鲜脑组织胼胝体提取等量的蛋白（100

μg）进行DSD-PAGE（12%T，5%C）分离，电转移至硝酸纤维素膜，室温用5%牛奶封闭30 min，NF-200（1∶200）、PLP（1∶500）一抗4 ℃孵育过夜后，漂洗3次，每次10 min。用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶500）稀释液室温孵育1 h后，用化学荧光检测系统染色洗片。采用FluorChem

8900，version 4.0.1（Aipha Innotech Corporation，USA）软件测量免疫条带的光密度。 1.2.5 电镜 出生后28 dGpr56+/-和Gpr56-/-小鼠各3只用2%福尔马林+3%戊二醛溶液灌流固定后，取大脑胼胝体制成1 mm3组织块。用震荡切片机将组织块切成80～100 μm的切片。0.1M磷酸盐缓冲液漂洗后，用1%四氧化锇后固定2 h，脱水、树脂包埋。切超薄切片，在Philips CM 120电镜（FEI Company， Hillsboro， Oregon， USA）下观察。从每只动物胼胝体近中侧取四个非重叠视野，拍不同倍数的照片。用Image J software （SummaSketch Ⅲ Summagraphics， Seattle， WA）测量每个神经纤维轴突和总神经纤维（轴突+髓鞘）的直径。用公式g-ratio=神经纤维轴突直径/总神经纤维（轴突+髓鞘）的直径计算g-ratio值。这个公式等同于神经纤维轴突横截面积除以总神经纤维的横截面积。比较Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠神经纤维直径的大小。研究者采取盲法测量Gpr56+/-和Gpr56-/-组g-ratio值，两组之间的比较采取成组t检验。

1.2.6 统计学方法 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组之第 4 页 间比较用成组t检验，以P[10]。MBP和PLP是成熟髓鞘的标志性蛋白[10]。髓鞘的形成障碍会导致MBP和PLP的合成减少，因此可以表明Gpr56基因敲除可导致轴突低髓鞘化。电镜结果发现，在P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体内髓鞘化 免疫荧光组织化学染色显示NF-200在出生后14 d、21 d和28 d Gpr56+/-（图2A， B， C）（x200）和Gpr56-/-（图2D，E，F）（×200）小鼠胼胝体中表达。Western免疫印迹显示NF-200在出生后7 d、14 d、21 d 和28 dGpr56+/-和Gpr56-/-（图2G）小鼠胼胝体中表达。Western免疫印迹条带光密度测定后统计学分析结果见图2F（aP60 μm范围内的百分比见图3G（aP[11]。神经微丝蛋白（neurofilament protein，NF）是构成神经元胞体和轴突细胞骨架的主要成分，对维持细胞的正常形态，参与细胞的物质转运和细胞运动，参与神经元信息的传递和DNA的复制、转录等方面起着重要作用[12-13]。NF按相对分子质量可分为NF-68、NF-150和NF-200[14-15]。NF-68组成神经丝的核心，NF-150和NF-200为“交联”蛋白，组成神经丝的侧臂[16-17]。NF-200仅存在于轴突中，因此NF-200可以反映轴突的生长情况[16-17]。当神经元轴突生长发生障碍时NF-200表达就会降低[16-17]。免疫荧光染色和Western blot发现：与对应的Gpr56+/-小鼠比较，P14 d、P21 d、P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体内NF-200表达明显降低且NF-200阳性轴突变短排列紊乱。电镜结果也发现P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体内神经元轴突的直径明显变小。在体外进行Gpr56+/-和Gpr56-/-神经元培养24 h后，用神经元特异性标志蛋白Tuj1染色发现：Gpr56-/-神经元轴突长度明显短于Gpr56+/-神经元轴突。因此，体外细胞培养实验结果与动物实验结果一致。建立在这些实验基础之上，第 5 页 可以推测Gpr56蛋白分子是神经元轴突正常发育所必需，缺乏它会导致轴突发育障碍，从而也会导致脑白质轴突低髓鞘化。这一发现对于理解和治疗轴突损伤相关性疾病有极其重要的意义。

希望以上资料对你有所帮助，附励志名言3条：

1、要接受自己行动所带来的责任而非自己成就所带来的荣耀。

2、每个人都必须发展两种重要的能力适应改变与动荡的能力以及为长期目标延缓享乐的能力。

3、将一付好牌打好没有什么了不起能将一付坏牌打好的人才值得钦佩。

第 6 页