逍遥散对肝郁脾虚证模型大鼠海马TPH2与IDO1的调节作用

2024年3月17日发(作者：suv有哪些车型)

逍遥散对肝郁脾虚证模型大鼠海马TPH2与IDO1的调节作

用

焦海燕;严志祎;马庆宇;周岩;李晓娟;潘秋霞;王亭晔;刘玥芸;陈家旭

【摘 要】Objective:To observe the expression of TPH2 and IDO1 in

hippocampus of rat with syndrome of liver depression and spleen

deficiencyand to explore the regulating effect of s:Male

SD rats were randomly divided into 4 groups:normal groupmodel

groupxiayaosan group and fluoxetine groupeach including 6 liver

depression and spleen deficiency model was established by chronic

immobilization stress for 21 expression of TPH2 and IDO1 were

detected by Fluorescent quantitative PCR and Western-blot

s:The mRNA expression of TPH2 in hippocampus of model

group decreased significantly compared with the other groups

(P<0.05);xiaoyaosan and fluoxetine could increase the TPH2 mRNA

mRNA expression of IDO1 in hippocampus of model group

increased significantly (P<0.01);xiaoyaosan and fluoxetine had the down-

regulatory effect on IDO1 mRNA expression (P<0.01)which is more

obvious in xiaoyaosan protein expression of TPH2 in normal

group was higher than the other groups (P<0.01)which of xiaoyaosan

group was higher than model group (P<0.05);the protein expression of

IDO1 in model group increased significantly compared with the other

groups (P<0.01).Conclusion:The expression of TPH2 decreases and IDO1

increases in liver depression and spleen deficiency model ratsand

xiaoyaosan has a therapeutic effec by regulating TPH2 and IDO1 in

hippocampus to influence the content of 5-HT.%目的:观察肝郁脾虚证模型大

鼠海马色氨酸羟化酶2(TPH2)与吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)表达的变化并探讨

逍遥散的调节作用.方法:雄性SD大鼠随机分成4组,分别是正常组、模型组、逍遥

散组、氟西汀组,每组6只.采用慢性束缚应激的方法制备大鼠肝郁脾虚证模型,造模

持续21 d.通过荧光定量PCR与Western-blot方法检测各组大鼠海马TPH2与

IDO1的表达情况.结果:模型组大鼠海马TPH2 mRNA的表达水平低于其余3组大

鼠(P<0.05),逍遥散与氟西汀对TPH2 mRNA的表达有一定的上调作用;模型组大鼠

海马IDO1 mRNA的表达显著增加(P<0.01),逍遥散与氟西汀对IDO1 mRNA表达

的下调作用明显(P<0.01),且逍遥散对IDO1 mRNA的下调作用更明显.模型组、逍

遥散组、氟西汀组大鼠海马TPH2的蛋白的表达低于正常组(P<0.01),逍遥散组

TPH2蛋白表达高于模型组(P<0.05);模型组大鼠海马IDO1的蛋白表达显著高于

其余3组(P<0.01).结论:肝郁脾虚证模型大鼠海马TPH2的表达减少,IDO1的表达

增多,逍遥散可能通过调节海马TPH2与IDO1的表达水平进而影响5-HT的含量,

起到治疗作用.

【期刊名称】《世界中医药》

【年(卷),期】2017(012)003

【总页数】5页(P494-498)

【关键词】肝郁脾虚证;逍遥散;TPH2;IDO1

【作 者】焦海燕;严志祎;马庆宇;周岩;李晓娟;潘秋霞;王亭晔;刘玥芸;陈家旭

【作者单位】北京中医药大学基础医学院,北京,100029;北京中医药大学基础医学

院,北京,100029;北京中医药大学基础医学院,北京,100029;北京中医药大学基础医

学院,北京,100029;北京中医药大学基础医学院,北京,100029;北京中医药大学基础

医学院,北京,100029;北京中医药大学基础医学院,北京,100029;北京中医药大学基

础医学院,北京,100029;北京中医药大学基础医学院,北京,100029

【正文语种】中 文

【中图分类】R228

肝郁脾虚证是常见的中医证候，肝失疏泄，脾失健运，其主要表现有胸胁作痛、情

志抑郁、腹胀、便溏等。现代研究发现，肝郁脾虚证的发病机制与5-HT系统紊乱

密切相关[1]。色氨酸羟化酶(Tryptophan Hydroxylase，TPH)是5-HT合成途径

中的唯一限速酶，是5-HT合成的重要前提，可作为5-HT能神经元的特异标志及

一个分化特征[2]。TPH2作为TPH的2种亚型之一，主要调控中枢5-HT的合成，

其基因的异常表达可能导致情感障碍和自杀行为[3]。吲哚胺2，3-双加氧酶

(Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)是一种色氨酸降解酶，可以使色氨酸更

多地代谢为犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)，导致生成5-HT的原料不足，从而减少

5-HT的合成。IDO包括2种同源蛋白—IDO1与IDO2，IDO1可以降解色氨酸

而引起色氨酸的缺乏，抑制T淋巴细胞增殖而促进其凋亡，同时诱导产生调节型T

细胞介导免疫耐受，其在炎性反应、感染、妊娠、器官移植、抑郁症、过敏、肿瘤

等多种病生理机制中都起着重要作用[4]。

肝主疏泄、调畅气机，肝脏是人体应激机制的调节中心[5]，许多实验也证明了肝

脏疏泄功能对于机体应激调节起到关键作用，与神经内分泌免疫调节网络密切相关

[6]，海马是与情感、情绪密切相关的重要脑区，富含各种神经递质及受体，对应

激最为敏感，且是应激反应的高位调节中枢，慢性应激可引起海马结构和功能的变

化。本实验通过慢性束缚应激的方法复制大鼠21 d肝郁脾虚证模型[7]，观察模型

大鼠海马中TPH2与IDO1表达的改变，同时以疏肝健脾的经典复方逍遥散为治

疗药物[8]，研究肝郁脾虚证发生的生物学机制，为逍遥散治疗肝郁脾虚证的临床

应用提供实验基础，以此探讨逍遥散与肝郁脾虚证的方证关联性。

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，清洁级，共24只。动物许可

证号：SCXK(Beijing)2012-0001。全部大鼠在实验前适应性饲养1周，饲养于北

京中医药大学实验动物中心三级实验室。实验室温度为(22±2)℃，湿度60%±5%，

正常光照昼夜节律，维持安静环境。

1.1.2 药物 实验中所用方剂选用《太平惠民和剂局方》中的逍遥散(北柴胡30 g、

当归30 g、白芍30 g、白术30 g、茯苓15 g、炙甘草15 g、生姜10 g、薄荷

10 g)。由北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司提供，根据《北京市中药炮制规

范》，按原书配伍比例由中日友好医院中药制剂室煎煮、浓缩制成药粉备用，1 g

药粉含生药量3.18 g，使用时用去离子水溶解配制成混悬液。实验中使用的盐酸

氟西汀胶囊，Patheon France，由礼来苏州制药有限公司分包装，20 mg/粒。

1.1.3 试剂与仪器 TRZOL Reagent(Sigma)，DEPC(Sigma)，氯仿(国产分析纯)，

异丙醇(国产分析纯)，RevertAidTM第一链cDNA Synthesis试剂盒(Thermo

Scientific)，2×SYBR Green Mix(Biomiga)，手持电动匀浆器(KONTES，ΜSA)，

荧光定量PCR仪(BIO-RAD)，BCA蛋白定量试剂盒，RIPA裂解液(Biomiga)，过

硫酸铵(Sigma)，30%丙烯酰胺，10×TBST(Solarbio)，PBS盐酸缓冲液，

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，10×电转液，4×SDS-PAGE分离胶缓冲液，4×SDS-

PAGE浓缩胶缓冲液(Solarbio)，甲醇(北京化工厂)，TEMED(北京拜尔迪生物技术

有限公司)，Anti-Indoleamine2,3-dioxygenase抗体(ab106134)，Anti-TPH2

抗体(ab121013)，辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金桥)，β-actin(Thermo

Scientific)，超敏化学发光液(Thermo Scientific)，Tanon-5200分析系统(上海天

能科技有限公司)，PVDF膜(0.45 μm，Thermo Scientific)，电泳仪(BIO-RAD)，

全波长扫描酶标仪(Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备与分组 24只SD大鼠随机分为4组，每组6只，分别为：正常组、

模型组、逍遥散组、氟西汀组，采用大鼠束缚架(自制)制备慢性束缚应激的方法大

鼠21 d肝郁脾虚证模型，大鼠束缚架为木质结构，底座宽10 cm、长20 cm、厚

1 cm。上面束缚台长22 cm，宽6.6 cm，前端有小架可固定大鼠头部，束缚台两

侧分别为两条可调节的粘贴软带，用于束缚大鼠的胸部和腹部。

实验中，正常对照组大鼠不加任何实验条件常规饲养，其余3组大鼠每天束缚3 h。

在束缚前1 h，正常组和模型组大鼠灌服去离子水，逍遥散组灌服逍遥散混悬液，

按人体用药量换算成大鼠等效剂量，给药量为0.61 g/100 g体质量(相当于生药量

1.927 g/100 g)，氟西汀组灌服氟西汀溶液，给药量为0.2 mg/100 g体质量，大

鼠的灌胃容积为1 mL/100 g体质量。造模持续21 d。

1.2.2 取材 造模结束后进行取材，采用2%戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉大鼠(40

mg/kg)，冰上取出脑组织，分离海马，然后一半置于有RNA保存液的冻存管中

4 ℃储存，另一半放入普通冻存管中后置于液氮中，待取材全部结束后将装有海马

的RNA保存液的冻存管放置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR

1.2.3.1 下丘脑总RNA的提取 将每个海马组织加入500 μL预冷Trizol的离心管

中快速研磨，室温放置5 min；以每1 mL Trizol加入0.2 mL的比例加入氯仿，

盖紧离心管，剧烈摇荡离心管15 s，然后室温静置3 min，后4 ℃、12 000

r/min离心15 min，样品分为三层，取上层水相于另一干净离心管中，按之前每

1 mLTrizol液加入0.5 mL异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10 min，然后

4 ℃，12 000 r/min离心10 min；弃去上清液，按每1 mLTrizol加入1 mL的

比例加入75%乙醇，混匀后4 ℃，7 500 r/min离心5 min；小心弃去上清液，

然后室温或真空干燥5～10 min，后将RNA溶于无RNA酶水中，保存于-80 ℃

备用。

1.2.3.2 总RNA的质量和浓度检测 取出1 μLRNA样品稀释50倍，应用紫外分光

光度计测定RNA的浓度和纯度。根据A260的值计算RNA浓度(单位：μg/μL)，

并根据A260/A280比值计算纯度，要求为1.8～2.0，比值低于1.5或高于2.2者

弃去。

1.2.3.3 合成第一链cDNA 按RevertAidTM第一链cDNA Synthesis试剂盒说明

书操作，20 μL反应体系，在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加

入总RNA、随机六聚体引物1 μL，然后补充无核酸酶的高纯水至12 μL；短暂离

心后，65 ℃孵育5 min，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却；按照顺序加入4 μL

5X Reaction Buffer、1 μL RiboLockTM RNA酶抑制剂(20 μ/μL)、2 μL 10 mM

dNTP Mix、1 μL RevertAidTM M-MuLV逆转录酶(200 μ/μL)，共20 μL；轻轻

混匀，离心，25 ℃孵育5 min，随后42 ℃孵育60 min；70 ℃加热5 min终止

反应，-80 ℃保存。

1.2.3.4 PCR实验引物 本实验采用由上海生工生物工程有限公司设计的引物进行实

验。

TPH2 REVERSE(TTGGAAGGTGGTGATTAGGC)，

FORWARD(CCATCGGAGAATTGAAGCAT);IDO1

REVERSE(GCTTCCCATTCTCAATCAGC)，

FORWARD(GGGCTTTGCTCTACCACATC);GAPDH

REVERSE(TGGTCCAGGGTTTCTTACT)，

FORWARD(CCATTCTTCCACCTTTGAT)。

1.2.3.5 实时荧光定量PCR 按照试剂盒说明书配制PCR反应体系(50 μL)，

2×SYBR Mixture(With Rox)25 μL，Forward Primer 10 μM，Forward Primer

10 μM，cDNA样品2 μL(1～10 ng)，补充至50 μL。

在荧光定量PCR仪上设置运行参数(预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 15 s，退

火/延伸，60 ℃ 1 min，溶解曲线分析65 ℃至95 ℃，每5 s增长0.5 ℃)，然后

进行两步法PCR反应。

1.2.4 Western-blot

1.2.4.1 蛋白提取和蛋白含量测定 每20 mg海马组织加入100 μLRIPA裂解液，

用手动匀浆器匀浆，然后冰上放置30 min，后4 ℃，12 000 r/min离心15 min；

所得上清液即为总蛋白，转存于-20 ℃冰箱备用。采用BCA蛋白定量试剂盒测定

总蛋白含量，用酶标仪于562 nm处测定吸光度，然后绘制标准曲线，计算出蛋

白浓度。

1.2.4.2 实验步骤 1)配置10%分离胶与5%浓缩胶，然后蛋白上样，体积为20 μL，

上样量为50 μg；2)电泳：先以80V电泳30 min，然后120V电泳1 h；3)转膜：

转膜采用200 ma，1.5 h，选用PVDF膜；4)封闭：用膜封闭液将转好的PVDF

膜室温摇床封闭2 h；5)孵育一抗：用膜封闭液稀释一抗(TPH2为1∶500，IDO1

为1∶50，β-Actin为1∶3 000)，膜置于杂交袋中4 ℃孵育过夜；6)孵育二抗：

第二天将杂交袋取出放置至室温，后TBST摇床水洗3×10 min，然后杂交袋摇床

孵育二抗1 h，然后TBST摇床水洗3×10 min；7)显影：将膜正面向下放入配置

好的显影液中2 min，然后通过Tanon-5200分析仪进行曝光拍照。

1.3 统计学方法 运用SPSS 21.0软件，对数据做正态性检验和方差齐性检验，两

项均符合，采用单因素方差分析(One-Way，ANOVA)进行统计计算。若数据不正

态或方差不齐，则采用K个独立样本的非参数检验逐项统计。以P<0.05为差异有

统计学意义。

2.1 各组海马TPH2与IDO1基因表达结果 采用2-△△Ct相对定量法计算各组大鼠

基因的相对扩增效率，其公式为：F=2[(待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基

因平均Ct值)-(正常组目的基因平均Ct值-正常组内参基因平均Ct值)]，其结果如

下。

与正常组相比，21 d慢性束缚应激能够明显下调其余3组大鼠海马TPH2 mRNA

的表达水平(P<0.05)，并且逍遥散与氟西汀对TPH2 mRNA的表达有一定的上调

作用；同样相比于正常组，造模能够明显上调模型组大鼠海马IDO1 mRNA的表

达水平(P<0.01)，而逍遥散与氟西汀对IDO1 mRNA表达的下调作用明显

(P<0.01)，且逍遥散对IDO1 mRNA的下调作用更明显。见表1、图1。

2.2 各组海马TPH2与IDO1蛋白表达结果 采用Tanon Gis软件对所得各组WB

条带图像灰度值进行分析，通过比较各组目标条带灰度值/内参灰度值的数值，得

出各检测指标蛋白表达的相对含量值，然后进行统计分析。见图2。

与正常组相比，模型组、逍遥散组、氟西汀组3组大鼠海马TPH2的蛋白的表达

明显减少(P<0.01)，并且逍遥散对TPH2蛋白表达有一定的上调作用，这一作用

优于氟西汀(P<0.05)；同样的，造模能够明显上调模型组大鼠海马IDO1的蛋白表

达水平(P<0.01)，并且逍遥散与氟西汀对IDO1的蛋白表达有明显的下调作用

(P<0.01)。见表2、图3。

本实验通过慢性束缚应激的方法，复制了21 d肝郁脾虚证大鼠模型，实验中采用

了逍遥散作为干预药物，西药氟西汀作为对照药物。在实验中，大鼠海马TPH2

与IDO1的基因表达与蛋白水平发生了变化，造模使TPH2的表达下调的同时上

调了IDO1的表达，且基因与蛋白表达结果基本一致。研究显示，5-HT系统紊乱

与情绪抑郁、食欲减退、失眠、昼夜节律紊乱、内分泌功能紊乱、性功能障碍、焦

虑不安、活动减少等密切相关。TPH的活性直接决定5-HT含量的变化，因此有

学者提出TPH调控影响的研究比5-HT本身含量的研究更有价值[9]。TPH-2主要

控制着中枢5-HT的合成，其基因的异常可能导致各类情感障碍，严重者能导致自

杀行为。研究表明，TPH2基因在脑内海马、中缝核中表达丰富[10]，而海马作为

边缘系统的重要组成部分，是与情感、情绪密切相关的重要脑区，富含各种神经递

质及受体，对应激最为敏感，是应激反应的高位调节中枢，慢性应激可引起海马结

构和功能的变化[11]，这是目前研究肝郁脾虚证的重要靶点之一。IDO1作为在情

感障碍疾病的发病及治疗过程中都具有重要作用，与单胺类递质、细胞因子及神经

元可塑性密切相关[12]。IDO1的过度激活可以使色氨酸更多的代谢为犬尿氨酸，

而色氨酸作为必需氨基酸和5-HT的前体物质，在没有大量外界摄入的情况下，其

含量的减少会导致5-HT水平下降。此外，激活的IDO1还可以加速5-HT的代谢，

使5-HT进一步减少。IDO1同时也是炎性反应诱导型酶，且细胞因子间具有协同

效应，机体免疫系统的激活可以引起细胞因子过度分泌，诱导激活IDO1，影响神

经递质的代谢。情绪脑区神经生成减少或退化增加导致了情感障碍，而IDO1作用

下的色氨酸-犬尿氨酸通路的部分代谢产物，如3-羟基犬尿氨酸、喹啉酸等具有神

经毒性作用，可以导致神经元的退化而影响神经可塑性[13]。J Mao等[14]应用

IDO1阻断剂1-MT及SSRI类抗抑郁药对抑郁模型小鼠进行干预，结果显示模型

组小鼠海马IDO1较正常组升高，TPH2与正常组无显著性差异，IDO1/TPH2显

著升高；单独应用1-MT及联合用药对各指标有调节作用，而单独应用SSRI组

IDO1/TPH2较模型组没有统计学意义。TPH2作为5-HT合成过程中的关键酶直

接调控5-HT生成，IDO1则通过降解色氨酸为犬尿氨酸间接影响5-HT含量。当

IDO1表达过多导致色氨酸含量减少而TPH2催化功能的改变不能弥补由色氨酸不

足导致的5-HT合成减少时，机体对应激刺激的敏感性增加，可能会导致多种情感

类障碍。因此，TPH2与IDO1作为色氨酸代谢生成5-HT途径的重要调控指标，

能够导致5-HT合成不足，这与肝郁脾虚证的发生密切相关。实验结果表明，逍遥

散与氟西汀对TPH2与IDO1均有一定的调节作用，且逍遥散的调节作用更为明

显。有文献报道，抑郁模型大鼠海马TPH mRNA表达减少，而氟西汀能够上调

TPH的表达[15]，且长期的氟西汀治疗对海马TPH2 mRNA表达具有上调作用

[16]。因此氟西汀虽作为本实验的阳性对照药物，其本身为SSRI类药物虽能增加

突触间隙内5-HT的含量，但可能会因色氨酸的减少导致突触前膜5-HT合成和贮

存不足而产生快速抗药反应，减弱其疗效[17]。而逍遥散具有疏肝解郁、养血健脾

的功效，早期主要应用于妇科疾病的治疗中。随着中医学的现代发展，有利的情绪

能够促进疾病的恢复，情志与临床疾病关系研究的深入，逍遥散的应用范围也随之

增大，几乎涵盖了人体的所有系统。逍遥散治疗肝郁脾虚证，因其整体调节、辨证

论治、个体化诊疗等理念的渗透，显示了明显的优越性。

综上所述，本实验观察了慢性束缚应激大鼠海马TPH2与IDO1基因蛋白表达情

况，逍遥散作为治疗肝郁脾虚证最常用的经典名方之一，其作用靶点较多，也对

TPH2与IDO1的含量变化有一定的调节作用，它们均通过作用于5-HT前体物质

—色氨酸来调节5-HT的含量，研究它们之间的相互作用关系是进一步为肝郁脾虚

证的中枢机制与逍遥散治疗肝郁脾虚证提供实验依据。

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