葡萄VvCOL5基因克隆及在胚珠发育过程中的表达分析

2024年3月3日发(作者：卡罗拉优点混合售价)

刘炳臣;唐玉瑾;魏蓉;王跃进;张朝红

【摘要】以葡萄无核品种无核白和有核品种黑比诺为材料,克隆葡萄CONSTANS基因家族的1个成员并将其命名为VvCOL5基因,分析基因结构,进行染色体定位和系统发育树的构建,检测VvCOL5基因在无核和有核葡萄胚珠(幼种子)发育过程的表达变化.结果表明:VvCOL5基因cDNA长度为1 374 bp,包含有2个外显子和1个内含子结构,并含有2个B-box结构域和1个CCT结构域,属于CO家族的第一类,在GenBank登录号为KX077245.在受精后胚珠(幼种子)发育过程中,VvCOL5基因在无核白与黑比诺中呈现出了相反的表达模式.其无核白受精后10～30 d其表达缓慢上调,30～35 d维持在较高水平,35～40 d缓慢下降,后在40～45 d又快速上调到较高水平;而在黑比诺中10～20 d下降,在20～35 d之间相对平稳,35～40 d缓慢上升,最后40～45 d时又下降到较低水平.无核白中VvCOL5基因在各时期的表达量均高于黑比诺,可见VvCOL5基因在无核和有核品种中表达差异较大,其与葡萄种子发育有一定关系.

【期刊名称】《西北林学院学报》

【年(卷),期】2017(032)001

【总页数】7页(P114-120)

【关键词】葡萄;VvCOL5基因;基因克隆;表达分析

【作者】刘炳臣;唐玉瑾;魏蓉;王跃进;张朝红

【作者单位】西北农林科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林

科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100

【正文语种】中文

【中图分类】S663.1

葡萄是一种落叶藤本果树，是重要的经济类果树之一，营养价值丰富，含有多种微量元素，近年来，由于无核葡萄在鲜食和加工制干上的优势，使其逐渐成为葡萄产业发展和葡萄育种的主要方向。葡萄属于长日照植物，光照时数的长短对葡萄的各项商品属性都有很大影响。CONSTANS(CO)是光周期调控途径中的关键基因之一，属于植物开花研究的热点基因[1-3]，对葡萄的生长代谢起着至关重要的作用。

CONSTANS基因相对保守，每个CO家族的成员都包含有B-box类似的锌指结构域和1个CCT结构域[4-6]。其中根据B-box的结构差异可以将CO家族分为3类：第1类含有2个B-box结构域，第2类只有1个B-box结构域，第3类包含有1个B-box结构域和1个高度异化的B-box锌指结构域[4]。

CONSTANS基因是通过拟南芥突变体克隆研究获得的一个光周期反应途径中关键的转录调控因子[7]，其作为光周期下游基因可以将光信号转换为开花信号传递给FT基因，从而促进CO基因mRNA积累使植物开花[8-10]，它和FT基因都是光周期途径中的关键基因[11]，CO基因节律表达的蛋白量很低[12]，并且受光周期精确调控的蛋白表达丰度是开花时间的限制因子。另外，研究还发现CO基因转录

的mRNA呈渐进方式积累，当达到一定域值时，能够明显地促进TFL、LEY基因的表达，并加速花的发育[13-14]。但在不同植物和不同条件下，光照长短对植物开花所起到的作用并不相同，如在拟南芥中，长日照条件下，CO基因能够促进开花，而在短日照条件下，其对开花的促进作用并不大[15-17]；但水稻的CO-like基因Hd1在短日照条件下促进开花，在长日照条件下反而抑制开花[18]。

在拟南芥中对CONSTANS家族基因的研究集中在对开花时间调控机理方面，主要包括CONSTANS-LIKE 7基因对拟南芥开花的调控[19]、CONSTANS-LIKE 7对拟南芥向地性的调控[20]以及CONSTANS-LIKE 4基因对拟南芥的抗逆调控[21]等；对其他植物中的CONSTANS类似基因的研究主要停留在最基本的克隆分析方面，如包括版纳龙竹CONSTANS同源基因的克隆和分析[22]、番茄CONSTANS类似基因的克隆与表达分析[23]、砂梨CONSTANS基因的克隆及原核表达[24]以及银杏CONSTANS基因的克隆与序列分析[25]等。

目前对CONSTANS类似基因的研究多集中在对植物光周期的调控方面，而对于CONSTANS基因与种子发育的研究尚未见报道。在项目组前期构建的无核葡萄胚珠cDNA文库中，发现一个EST与拟南芥CONSTANS基因同源的基因，推测该基因可能与种子发育有关，所以本研究进一步克隆葡萄CONSTANS基因VvCOL5基因，对测序得到序列进行分析，并对其在无核白与黑比诺胚珠不同发育时期的表达进行检测，探讨VvCOL5基因与葡萄有核品种种子发育和无核品种种子败育的关系，探究无核葡萄形成的机理。

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料葡萄(Vitis vinifera)无核品种无核白和有核品种黑比诺，种植于西北农林科技大学园艺学院葡萄种质资源圃，由于两者花期均从5月中下旬开始，故在2015年5月开花前后对花穗进行人工处理，具体参照巩培杰[26]的采样方法：选取大小基本相近的花穗，将葡萄花穗顶部的花蕾和已经盛开的花朵摘除，每株葡

萄选取4～5穗，然后用纸袋套袋处理，套袋后3 d内将尚未开放的花蕾摘除，以使花期保持基本一致。从花后的第10天开始，每隔5 d随机选取大小基本相同的果穗取样，共采集8次，时期为10～45 d，将样品放入冰盒中带回实验室，于冰上剥离胚珠，并用2 mL离心管分装，经液氮速冻后放入-80℃冰箱中备用。

1.1.2 相关仪器及试剂 Real-Time PCR检测仪器为Bio-Rad iQ5型；pMD19-T载体、LA Tap DNA聚合酶、SYBR Green Ⅱ绿色荧光混合试剂购自大连TaKaRa公司；感受态大肠杆菌 TOP10、胶回收试剂盒、DNA MARK Ⅲ、FastQuant RT Kit反转录试剂盒购自北京天根公司；E.Z.N.A? Plant RNA Kit 试剂盒购自OMEGA公司；引物合成及序列测定由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成葡萄各时期总RNA的提取参照购自OMEGA公司的E.Z.N.A? Plant RNA Kit试剂盒的说明书进行。

以mRNA为模板，先配制基因组DNA的去除体系混合液，简短离心，置于42℃孵育3 min，然后将反转录反应中的Mix加入到gDNA去除的反应液中，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min后低温保存。

1.2.2 葡萄VvCOL5基因的克隆以葡萄基因组预测的CONSTANS基因XM_002277917.3为参考序列，使用引物设计软件设计相应引物，引物VvCOL5-F：5′-GAGAGACTGTTCCTACTTAC-3′；VvCOL5-R：5′-GAGAGGGAAAAAACACAGT-3′。

克隆方法及体系参照魏蓉[27]以无核白cDNA库液为模板，通过基因克隆技术获得目的基因VvCOL5的全长，将PCR产物连接pMD19-T载体后转入TOP 10大肠杆菌感受态，经单克隆菌液PCR筛选鉴定后送阳性菌液测序鉴定，3次重复。

基因克隆反应体系为25 μL体系：模板cDNA1 μL，上下游引物各1 μL，

10×LATaq buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，LA Taq DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O补齐至25 μL；PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2

min，37循环；72℃ 10 min。

1.2.3 葡萄VvCOL5基因的序列分析首先将克隆得到的VvCOL5基因序列输入葡萄基因组网站获得VvCOL5基因序列对应的基因组序列，使用FGENESH-C对目标序列的内含子和外显子结构进行分析；然后使用NCBI分析目标基因在葡萄染色体的定位信息；使用NCBI对VvCOL5基因的保守结构域进行预测；最后使用MEGA 5.0软件对葡萄VvCOL5基因的蛋白序列与番茄、烟草、蓖麻、水稻、大麦、玉米、草莓以及大豆的CONSTANS类似基因的蛋白序列进行多序列比对分析，获得VvCOL5蛋白与其他植物中同源CONSTANS类似基因蛋白序列的亲缘关系，并将VvCOL5基因与拟南芥CO家族所有成员构建系统发育树，探索VvCOL5基因在CO家族中的分类。

1.2.4 葡萄VvCOL5基因的RT-PCR表达分析使用软件设计RT-PCR引物，引物RVvCOL5-F:5’- CAAAGCATTTCATCTTCAGATGTTG-3’；RVvCOL5-R:5’-

GGGTCGCTTGACTCCCAGTA-3’，并通过NCBI的BLAST功能对引物的特异性进行比对鉴别。以Actin为内参(RVvACT-F:5’-CTCTATATGCCAGTGGGCGTAC-3’;RVvACT-R:5’-CTGAGGAGCTGCTCTTTGCAG-3’)，以无核白、黑比诺葡萄花后胚珠不同发育时期的cDNA为材料，利用RT-PCR技术对其表达进行检测分析，每个定量PCR反应均设3次生物学重复。

QRT-PCR反应体系及程序参照巩培杰[26]：模板cDNA 1 μL，上下游引物各0.8

μL，SYBR绿色荧光染料10 μL，ddH2O 8.4 μL。QRT-PCR使用The iQ5 Real-Time PCR Detection System仪器进行，反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 10 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，50个循环；55℃ 15 s，81个循环。

2.1 葡萄VvCOL5基因的克隆

以葡萄基因组预测的CONSTANS基因XM_002277917.3为参考序列设计引物，通过基因克隆技术扩增得到1条约1 374 bp长度的条带(图1)，与预测的长度一致，由于该基因为葡萄CONSTANS-like protein基因，属于CO家族成员，故将其命名为VvCOL5基因，将其回收连接到pMD19-T载体，转入大肠杆菌感受态细胞Top 10，经菌液PCR筛选检测后送阳性菌液测序。

2.2 葡萄VvCOL5基因的序列分析

序列分析表明，序列长度为1 374 bp，通过ORF Finder找到一个长1 086 bp的开放阅读框，位于84～1 170 bp之间，编码361个氨基酸，预测的分子量为38.99 KD，等电点为6.593，经染色体定位显示其位于11号染色体，位置为19

620 905～19 622 362，其基因序号为GSVIVT ，将获得的序列提交至GenBank，登录号为KX077245。

以克隆得到VvCOL5基因的cDNA序列与其对应的葡萄基因组DNA序列比对，揭示VvCOL5序列的内含子/外显子的结构特征，结果显示VvCOL5含有2个外显子和1个内含子结构。

利用NCBI的BLASTP的PROSITE蛋白质数据库对VvCOL5基因的氨基酸序列进行分析表明，在21～62 aa处和63～108 aa处各包含有一个B-box保守结构域，而在287～329 aa之间也包含一个CCT保守结构域(图2)，这些结构域都是CONSTANS基因的特征结构。而克隆的VvCOL5基因的氨基酸序列具有典型的CONSTANS类似基因的蛋白特征和保守结构域。

将VvCOL5的蛋白序列与番茄、烟草等8种植物的CONSTANS类似基因的蛋白序列以及拟南芥CO家族所有成员进行同源性分析并进行序列比对。结果表明，VvCOL5与番茄、烟草、草莓、大豆、大麦、水稻、蓖麻以及玉米的同源性分别为56.33%、44.52%、59.69%、65.34%、46.17%、41.93%、59.29%、

47.85%(图4)。然后VvCOL5基因与拟南芥CO家族的所有成员的进化树分析显示VvCOL5基因属于CO家族分类中的第1类(图3)。

2.3 葡萄VvCOL5基因的RT-PCR表达分析

利用RT-PCR技术对VvCOL5基因在无核白和黑比诺胚珠不同发育时期的表达进行检测显示，其在无核白10 d时处于整个胚珠发育时期的最低值，从10～30 d呈缓慢上调趋势，期间无核白中的胚乳逐渐完成细胞化，然后在30～35 d之间处于持平状态，而从32 d开始，无核白中的胚乳发生败育，而在之后的35～40 d之间出现了下降的趋势，随后从40～45 d之间又急速上调，这期间在40 d左右时出现了明显的拐点，而无核白中胚的败育就是在花后38 d[28]左右开始的，而VvCOL5在40 d之后的急速上升趋势与其胚珠败育开始时间刚好吻合，而在随后达到表达量最高值时候的45 d也正是无核白胚珠完成败育的时期；与VvCOL5基因在无核白中的表达趋势相比，在黑比诺中的表达趋势基本与无核白中的表达趋势完全相反，10 d时处于较高水平，此时为黑比诺整个胚珠发育时期中的最高值，之后从15～25 d表达相对平稳，而从30 d开始直到40 d呈现出相对缓慢的上调趋势，在此期间由于胚乳已经完全充满胚囊，在得到了充足的营养保障之后，黑比诺的胚开始加速发育， 40～45 d又下降到了较低水平，而此时的黑比诺胚珠已经基本固定大小并进入硬核期了，所以从定量结果可以看到，VvCOL5基因在无核白和黑比诺中呈现出了2种截然相反的表达趋势，并且无核白在每个胚珠发育的时期的表达量均高于同时期的黑比诺中的表达量，甚至是在无核白中表达量的最低值都基本与黑比诺中表达量的最高值持平，而且在无核白中的表达趋势与无核白中胚珠败育的时间节点是完全一致的，而对于2个品种的显著性分析也显示2个品种的差异极显著。

植物CONSTANS基因作为一种调控植物光周期途径的关键基因，对花发育有直接或者间接的促进作用[29]。以葡萄基因组预测的CONSTANS基因

XM_002277917.3为参考序列，通过普通PCR克隆技术将其克隆得到，然后对克隆得到的序列进行分析结果显示VvCOL5基因包含有2个外显子和1个内含子结构，对VvCOL5基因的氨基酸序列分析发现其包含有2个保守的B-box结构域和1个CCT结构域，这与其他植物中CONSTANS类似基因的结构域完全相符[4]，说明CONSTANS类似基因是相对保守的，最后通过多种植物之间构建系统发育树发现，VvCOL5基因与拟南芥CO家族所有成员的进化树分析显示其属于CO家族的第1类[4]，与之前的蛋白结构域预测的结果完全相符；然后VvCOL5基因与其他植物中的CONSTANS类似基因的同源度较高，其中与大豆的同源度最高达65.34%，而与水稻的同源度最低，但也达到了41.93%，而这样相同的基因结构和保守结构域可能与CONSTANS类似基因调控光周期的功能有关。

定量PCR是一种在DNA扩增反应中，通过内参或外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法，是现代生物学研究中常用的检测基因表达水平的技术手段，本研究采用RT-PCR对VvCOL5基因在2种葡萄胚珠不同发育时期的表达进行了分析，表明VvCOL5基因在无核白和黑比诺中表达趋势完全相反，由于无核白葡萄胚乳败育是发生在花后的32 d[28]，本试验中，VvCOL5基因在无核白中从10 d开始到30 d能呈现出明显的增长趋势，相对地在黑比诺中，从15

d开始到30 d其表达趋势变化较小，并且一直维持在相对较低的水平，而在花后的35～45 d VvCOL5基因在无核白和黑比诺中表达趋势呈现出相反的趋势，其中在黑比诺中先上升后下降，而无核白中则完全相反，由于VvCOL5基因在无核白与黑比诺胚珠不同发育时期的表达出现明显差异，并且在无核白胚珠败育的关键时期表现出极为明显的差异，推断VvCOL5基因可能在葡萄胚珠败育过程中发挥着重要作用。另外，在无核白胚珠发育过程中，VvCOL5基因在胚珠败育的关键时期30 d左右达到了表达量的最高值，而在胚珠败育的后期的35～40 d之间出现了下降趋势，并在随后急速上升，这些所有的时间节点与无核白胚珠败育的时间完

全相符，所以VvCOL5基因在无核白葡萄胚珠发育过程中表达量的变化表明，VvCOL5基因可能与无核白葡萄胚珠的发育相关。但目前对VvCOL5基因的研究仅仅显示其在黑比诺和无核白中表达存在差异，究竟CONSTANS类似基因是否对葡萄胚珠的败育以及无核白胚珠的发育具有影响，还需要对VvCOL5基因的功能和作用机制进行进一步的研究。

*通信作者：张朝红，男，副教授，硕士生导师，研究方向：无核胚珠败育机理。E-mail:************************.cn

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