北京1株犬源狂犬病病毒全基因组序列测定及分析

2024年1月10日发(作者：途安7座)

张弼;陈立本;张玮;刘庆斌;冯小宇;宋彦军

【摘要】本试验旨在对北京1株犬源狂犬病病毒株(BJ2012ZW株)在全基因组水平上进行分子进化研究,比较与全国流行株及疫苗株之间的差异.试验采集犬脑组织以直接免疫荧光技术和内基氏小体检查方法进行检测,以RT-PCR扩增病毒核酸覆盖全基因组,对产物测序后进行遗传学分析.结果显示,BJ2012ZW株狂犬病病毒属于基因1型,与目前中国的主要流行株全序列同源性为83.9％～99.7％.与同样分离自北京的毒株BJ2011E和CNM1101C的核苷酸全序列同源性最高(99.7％),进化关系近.G蛋白主要抗原位点分析结果表明,BJ2012ZW株与国内疫苗株相比有部分抗原位点发生了替换.BJ2012ZW株属于中国目前的流行株,与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异.

【期刊名称】《中国畜牧兽医》

【年(卷),期】2015(042)001

【总页数】7页(P17-23)

【关键词】狂犬病病毒;街毒株;全基因组;序列分析

【作者】张弼;陈立本;张玮;刘庆斌;冯小宇;宋彦军

【作者单位】北京市动物疫病预防控制中心,北京102609;北京市动物疫病预防控制中心,北京102609;北京市动物疫病预防控制中心,北京102609;北京市动物疫病预防控制中心,北京102609;北京市动物疫病预防控制中心,北京102609;北京市动物疫病预防控制中心,北京102609

【正文语种】中文

【中图分类】R373.9

狂犬病（rabies）又称恐水症（hydrophobia），是由狂犬病病毒引起的一种以中枢神经系统症状为主的急性、人畜共患传染病［1］。狂犬病在全球100多个国家和地区流行，死亡率近乎100%，全球每年约有55 000人死于狂犬病，数百万人接受狂犬病暴露后免疫治疗［2］。近年来狂犬病在中国呈上升趋势，北京自2005年以来，已连续10年出现人感染狂犬病致死病例。目前，国内分离出的狂犬病病毒街毒株均属于基因1型，但序列分析结果显示，不同街毒株间的核苷酸和氨基酸序列存在较为明显的差异［3］。本试验通过对北京1株犬源狂犬病病毒在全基因组水平上进行分子进化研究，旨在揭示流行于北京地区的毒株与其他流行株及疫苗株之间的差异，为北京市的狂犬病免疫、防控提供有价值的指导。

1 材料与方法

1.1 病料

病料采自北京某地区疑似患狂犬病的流浪犬，无菌采集病犬脑组织，于－70 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

Trizol 购自Invitrogen 公司；PCR 试剂盒（RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0）购自宝生物工程（大连）有限公司；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体购自美国CHEMICON 公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇等化学药品均为国产分析纯。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank已公布的中国狂犬病病毒分离株序列，参考BJ2011E 株（登录号：

JQ423952）全基因组核苷酸序列，采用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0软件设计出10对引物（表1），用于扩增狂犬病病毒的全基因，引物均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

表1 狂犬病病毒全基因组扩增用引物序列Table 1 Primers used in

amplification of the genome of rabies virus引物引物序列（5′→3′）长度（bp）位置PrimersPrimer sequenceLengthBase position 1 RV－AF－1

ACGCTTAACAACAAAACCATAGAA 1 396 1—1 396 RV－AR－1396

GCTTGATGATTGGAACTG 2 RV－BF－1211 TTGGCAGATGACGGGACT 1 101

1 211—2 311 RV－BR－2311 ACCCACCCCAATACACATCT 3 RV－CF－2076

CCACCAATGAAGAGGATGA 1 323 2 076—3 398 RV－CR－3398

TGGTATCGTGTAAATAGGGA 4 RV－DF－3379

GTGACCCCAGGTATGAAGAGT 1 736 3 379—5 114 RV－DR－5114

GGGTAAAAGCACCATTAGTCAC 5 RV－EF－4916 AAGTCCCGAAGACCTCAT

1 614 4 916—6 529 RV－ER－6529 GATGCCCCCAATGTCTGTA 6 RV－FF－6513 TTGCCTGACGAGGACTTGA 688 6 513—7 200 RV－FR－7200

GGGGCTCCACAGACTTCAA 7 RV－GF－7000 GGGGTTGTCATTCTGGAG 1

477 7 000—8 476 RV－GR－8476 TCTCCTCTAAGGGACGGCTC 8 RV－HF－8169 GCTGTGCCCCACTTTCA 1 732 8 169—9 900 RV－HR－9900

AGACATAGGGATGGGAAAACA 9 RV－IF－9460 AGCCCCCTTTTCAGAGC 1

052 9 460—10 511 RV－IR－10511 ACGCTTAACAAATAAACAACA 10 RV－JF－10359 TTGCCTGACGAGGACTTGA 1 566 10 359—11 924 RV－JR－11924 GGGGCTCCACAGACTTCAA

1.4 直接免疫荧光法（DFA）检测

取少量犬脑组织标本横断面直接印片，室温干燥30min后，用冷丙酮（4 ℃）固

定10min，用FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体染色，37 ℃湿盒孵育30min，弃染液，用PBS缓冲液振洗2遍，蒸馏水振洗1遍，自然干燥后用90%甘油封片，荧光显微镜下观察并记录结果。

1.5 内基氏小体（包涵体）检查

取犬大脑皮层的海马回部组织切片，用HE 染色法染色，并在光学显微镜下观察并记录结果。

1.6 病毒RNA的提取

取100mg脑组织样本，用剪刀剪碎，加入1mL Trizol Reagent，研磨至匀浆状，转移到1.5 mL 的EP管中，室温放置5 min，加入200μL 氯仿，轻微振荡混匀，4 ℃、12 000r／min离心10min，取上清600μL，加入600 μL 异丙醇，混匀

后室温静置10min，4 ℃、12 000r／min离心10min，弃上清，加入1 mL

75% DEPC 乙醇，12 000r／min 离心10min，弃上清，沉淀干燥后悬于适量的DEPC处理水中备用。

1.7 RT－PCR扩增及测序

按照PCR 试剂盒（RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0）说明书反转录合成cDNA，并以其为模板，用表1 中的10 对引物进行分段PCR 扩增。PCR反应体系50μL：5×PCR Buffer 10μL，灭菌蒸馏水28.75μL，Ex Taq HS 0.25μL，cDNA 10μL，上、下游引物各0.5μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃再延伸10min。取PCR 产物5μL，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳检查结果。将PCR 产物直接送北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。

1.8 序列比对分析

使用DNAStar软件包中的EditSeq、SeqMen、GeneQuest处理测序所得的狂犬病病毒基因序列，进行序列拼接、编辑、氨基酸翻译等；使用DNAStar软件包

中的MegAlign进行序列匹配和多重序列比对（Clustal W 法），并绘制系统进化树。本研究中所使用的21个全基因组参考序列（表2）均从Gen－Bank获得。

表2 狂犬病病毒GenBank参考序列Table2 Reference rabies virus sequences

used in this study from GenBank毒株Virus strain 来源Reservoir host 国家Country GenBank登录号GenBank Accession number Lagos bat virus 街毒株（蝙蝠）尼日利亚EU293110 Mokola virus 街毒株（人）津巴布韦 NC＿006429 Australian bat lyssavirus 街毒株（蝙蝠）澳大利亚 NC＿003243 PV

巴斯德疫苗株法国 M13215 PM1503 疫苗株德国 DQ099525 FluryLEP 疫苗株

德国 DQ099524 ERA 弱毒疫苗株德国 EF206707 HEP－Flury 动物疫苗法国

AB085828 CVS－11 标准攻毒株中国 GQ918139 CTN－1 疫苗株中国

FJ959397 4aGV 疫苗株中国 JN234411 MRV 街毒株（田鼠）中国 DQ875050

DRV 街毒株（梅花鹿）中国 DQ875051 F02 街毒株（鼬獾）中国 FJ712195

D01 街毒株（犬）中国 FJ712193 HN10 街毒株（人）中国 EU643590

BJ2011E 街毒株（马）中国 JQ423952 CQ92 街毒株（犬）中国 GU345746

FJ008 街毒株（犬）中国 FJ866835 J 街毒株（人）中国 GU345747

CNM1101C 街毒株（奶牛）中国KC193267

2 结果与分析

2.1 DFA 检测结果

犬脑组织样本荧光显微镜观察到翠绿色点状荧光，且阴阳性对照成立（图1），表明犬脑组织中含有狂犬病病毒。

2.2 内基氏小体（包涵体）检查结果

光学显微镜下可观察到在神经细胞胞浆中有圆形或椭圆形红色的包涵体（图2）。结合DFA 检测结果，从犬脑组织中分离到1株狂犬病病毒，命名为BJ2012ZW

株。

2.3 RT－PCR电泳结果

利用10 对特异性引物进行RT－PCR 扩增，结果显示分别扩增出长度为1 396、1

101、1 323、1 736、1 614、688、1 477、1 732、1 052、1 566bp的目的片段（图3），与预期结果相符。

2.4 狂犬病病毒的全基因组序列

经序列测定、拼接、比对后获得狂犬病病毒的全基因组核苷酸序列，序列全长11

924bp，符合典型狂犬病病毒基因组结构：3′UTR（1—58）、N 基因（59—1

483）、P 基因（1 486—2 475）、M 基因（2 481—3 283）、G 基因（3

289—5 355）、L 基因（5 380—11 854）、5′UTR（11 855—11 924）。编码区分别为：N 基因1 353bp（71—1 423）、P 基因894bp（1 515—2 408）、M 基因609bp（2 496—3 104）、G 基因1 575bp（3 316—4 890）和L 基因6 387bp（5 407—11 793）。基因起始信号为AACA，尾部信号为Ploy（A）尾AAAAAAA，各结构基因之间间隔区分别为2、5、5、24个。N－P－M－G 基因间隔区为CT、CAGGC、CTATT，与大多数狂犬病病毒基因组间隔区序列相同，但BJ2012ZW 株G 基因的Ploy（A）尾在终止密码子后459bp处，即成熟的G

基因mRNA 有一个较长的5′UTR，而使得GL 基因间的假基因区仅有24个核苷酸残基，这与大多数基因组不同。基因起始密码子ATG 和终止密码子TAA／TGA

与其他序列基本一致，但M 基因终止密码子为TAG。

图1 犬脑组织DFA检测结果Fig.1 DFA result of dog brain samplesA，阳性对照；B，脑组织样本；C，阴性对照A，Positive contrast；B，Brain sample；C，Negative contrast

图2 神经细胞胞浆内的包涵体观察结果（40×）Fig.2 The observation result of

inclusion body in nerve cells（40×）箭头所指为包涵体The black arrow was

pointing to inclusion body

图3 RT－PCR扩增BJ2012ZW 株各基因片段电泳图Fig.3 Electrophoregram of

gene fragment of BJ2012ZW strain amplified by RT－PCRM，100bp DNA

Marker；1～10，BJ2012ZW 株基因组各片段RT－PCR扩增产物M，100bp

DNA Marker；1－10，RT－PCR products of BJ2012ZW strain genome

2.5 基因组整体同源性比对分析

将BJ2012ZW 株基因序列与其他21株狂犬病病毒的基因序列（包括18株来自不同国家地区基因1型的狂犬病病毒和3株其他基因型狂犬病病毒）进行序列同源性比对分析并构建系统进化树，核苷酸、氨基酸同源性比对结果见图4，系统进化树结果见图5。由图4、5 可知，BJ2102ZW 株与基因3 型Mokola virus株核苷酸全序列同源性最低，为

图4 BJ2012ZW 全基因与其他狂犬病病毒全基因核苷酸和氨基酸序列同源性比对Fig.4 Homological comparison of nucleotide and amino acid sequence of

rabies virus strains

图5 狂犬病病毒全基因系统进化树Fig.5 Phylogenic tree of complete genome

of rabies virus

66.4 %。与其他基因1型街毒株相比，核苷酸全序列的同源性为83.9%～99.7%，BJ2012ZW 株与毒株BJ2011E和CNM1101C的核苷酸全序列同源性最高，为99.7%，各基因区域内的核苷酸同源性：N为85.3%～99.8%，P 为83.1%～99.6%，M 为85.4%～100.0%，G 为82.4%～99.7%，L 为84.8%～99.8%，病毒各结构基因编码氨基酸的同源性：NP 为93.1%～100.0%，PP 为86.9%～100%，MP 为92.1%～100.0%，GP 为85.7%～99.8%，LP 为95.7%～100.0%。BJ2012ZW 株与现行的人用和兽用疫苗株相比，核苷酸全序列的同源性为84.2%～88.3%，BJ2012ZW 株与CTN－1疫苗株核苷酸全序列同源性最高，为88.3%。各基因区域内的核苷酸同源性：N 为86.8%～89.9%，P为82.4%～

87.6%，M 为85.4%～91.0%，G 为82.9%～88.0%，L为84.8%～88.3%。病毒各结构基因编码氨基酸的同源性：NP为96.7%～99.1%，PP为87.2%～93.6%，MP 为92.1%～97.0%，GP为88.2%～94.7%，LP为95.7%～98.1%。

2.6 与国内主要疫苗株G蛋白的氨基酸序列比对分析

BJ2012ZW 株的G 基因包含了一个长为1 575bp，编码524 个氨基酸残基的开放读码框（ORF），其前19个氨基酸为疏水性信号肽，在转录过程中被切除，成为成熟G 蛋白，由505个氨基酸组成，有8个抗原位点位于G 蛋白的膜外区，其中主要的3个：GⅠ、GⅡ、GⅢ。GⅠ位于第231位氨基酸；GⅡ有2个抗原表位，第34—42和198—200位氨基酸；GⅢ位于第330—338 位氨基酸，第333位氨基酸R 为狂犬病病毒嗜神经性和毒力的关键。BJ2012ZW 株与现行的人用和兽用疫苗株相比，与CTN－1株的同源性最高，有26处氨基酸发生了替换。G 蛋白主要抗原位点分析结果表明，GⅠ中第231位上BJ2012ZW 株与所有毒株完全一致，均为亮氨酸（L）；构成G 蛋白抗原位点至关重要的序列GⅡ中的第198—200位上所有毒株也完全一致，但第34—42 位氨基酸序列中的第40 位，BJ2012ZW株与CTN－1、PV、HEP－Flury、ERA 和4aGV 株同为甘氨酸（G），而CVS－11、PM1503、FluryLEP为谷氨酸（E）。抗原位点GⅢ为空间依赖性位点，其主要抗原位点中的第332位氨基酸，BJ2012ZW 株为异亮氨酸（I），其余疫苗株均为缬氨酸（V）（表3）。

表3 BJ2012ZW 株与中国现用狂犬病疫苗株的G 蛋白主要抗原位点比较Table 3

Comparison of major antigenic sites of GP of BJ2012ZW strain with those

of the current rabies vaccine virus strains in China抗原位点Antigen site毒株StrainGⅠ GⅡ GⅢ231 34－42 198－200 330－338 BJ2012ZW L

GCTNLSGFS KRA KSIRTWNEI CTN－1 L GCTNLSGFS KRA KSVRTWNEI HEP－Flury L GCTNLSGFS KRA KSVRTWNEI PV L GCTNLSGFS KRA KSVRTWNEI

PM1503 L GCTNLSEFS KRA KSVRTWNEI FluryLEP L GCTNLSEFS KRA

KSVRTWNEI ERA L GCTNLSGFS KRA KSVRTWNEI CVS－11 L GCTNLSEFS

KRA KSVRTWNEI 4aGV P GCTNLSGFS KRA KSVRTWNEI

3 讨论

中国是狂犬病的主要危害地之一，据卫生部门的统计表明，中国自2001 年以来，疫情呈上升趋势［4］，主要在中国的中部、东部及南方各省份流行，而北京在1994—2004年连续11年没有人感染该病的报道［5］，但自2005年出现一例狂犬病以来，每年都有新发的人狂犬病病例，然而在动物上狂犬病病例的报道却很少。本研究通过DFA 检测和内基氏小体（包涵体）检测确诊了一例犬的狂犬病，并运用RT－PCR 方法分段扩增各基因片段，进行测序拼接得到1株病毒基因组全序列，命名为BJ2012ZW 株。该毒株基因组构成与大多数毒株全基因组序列相似，不同之处在于G 基因的mRNA 有一个较长的5′UTR，使得G－L间的假基因区由423个核苷酸残基缩短为24个，这种基因结构的不均衡性在SADB19、HEP－Flury等减毒株中也存在，有研究认为，这些基因可能是一种基因残留，或是病毒在细胞中适应和遗传进化的体现，是一种进化遗迹［6］。

BJ2012ZW 株与其他21 株狂犬病病毒的基因序列进行全序列比对，同源性在66.4%～99.7%之间，但与基因1型街毒株相比核苷酸全序列的同源性均大于83.9%。Wu等［7］研究结果表明流行于中国犬中的病毒都属于经典的狂犬病病毒，这些病毒可以分为两大支，并被分为4 个组。在本研究中，BJ2012ZW 株与中国其他地区狂犬病病毒街毒株的亲缘关系很近，它们在同一发生群，均属于1型狂犬病病毒。同时还与国内疫苗株有较近的进化关系，具有典型的中国地域特点。BJ2012ZW 株与分离自北京的马源BJ2011E 株和奶牛源CNM1101C 株，以及分离自福建的犬源FJ008株在全系列系统进化树同处于一个小分支上，说明在同一地区不同宿主及不同地区同一种宿主上分离到的病毒株同源性极高，从侧面证实了

各种带毒动物可能使病毒在不同地区之间迁移，并使得病毒在不同宿主间转换。此外，BJ2012ZW 株与同样自北京分离的BJ2011E 株和CNM1101C 株的核苷酸序列同源性达到99.7%，说明这3株病毒极有可能为同一株型或略有变异，分析结果表明这3株病毒可能是北京地区狂犬病病毒的流行株。

随着狂犬病病毒血清型变异，目前人用和兽用狂犬病疫苗毒株已不能提供针对所有种类狂犬病病毒的有效保护［8］，因此研究疫苗株与流行株之间的差异及疫苗对流行株在人和动物身上的保护效果对于狂犬病的防控尤为重要。BJ2012ZW 株与人用和兽用疫苗株CTN－1、4aGV、PV、PM1503、FluryLEP、ERA 和HEP－Flury在基因组整体和结构蛋白两方面的同源性分析结果表明，它们之间存在抗原交叉。BJ2012ZW 株与CTN－1 株的同源性高于其他疫苗株，且BJ2012ZW

株与CTN－1株在全序列系统进化树一个大的分支上，而其他疫苗株则在另一个大的分支上。G 蛋白既是狂犬病病毒的主要保护性抗原，能诱导机体体液免疫产生中和抗体和刺激T 细胞作用产生细胞免疫，又是狂犬病病毒与细胞受体结合的结构，并与毒力直接相关［9］，而G 蛋白至少有3个中和抗原位点：GⅠ、GⅡ和GⅢ，是狂犬病病毒的主要保护抗原，能诱导机体产生中和抗体，其中GⅡ和GⅢ是最重要的抗原位点［10］。G 蛋白氨基酸序列分析结果表明，BJ2012ZW

株与CTN－1株的同源性也明显高于其他疫苗株，但仍有26处氨基酸残基发生了替换，且在对狂犬病病毒的致病性和病毒中和抗体的产生起重要作用的抗原位点GⅢ中，BJ2012ZW 株G 蛋白的第332位氨基酸残基相对于疫苗株都发生了替换，但目前还不知道这个位置氨基酸替换是否会影响现有疫苗的保护效果［11］，需要开展更为深入的流行病学调查及对现有疫苗保护效果进行系统评价，以便更好地进行北京市狂犬病的发生、发展及其预防的研究工作。

参考文献：

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