二十二碳六烯酸对人胆囊癌GBC_SD细胞系生长的抑制作用_朱开成

2023年12月23日发(作者：西尔贝tuatara官方售价)

#524#JournalofQiqiharMedicalCollege,2009,Vol.30,No.5二十二碳六烯酸对人胆囊癌GBC-SD细胞系生长的抑制作用朱开成 王 建=摘要> 目的 探讨二十二碳六烯酸(DHA)对体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞增殖的影响。方法 采用体外细胞培养的方法,在处于指数生长期的GBC-SD细胞培养剂RPMI1640中分别添加12.5Lg/ml、25Lg/ml、50Lg/ml的DHA,培养24~72小时后,采用噻唑蓝法(MTT法)检测GBC-SD细胞的增殖情况,光镜下观察细胞形态变化。采用DNA琼脂糖凝胶电泳、AnnexinV-FITC/PI染色荧光显微镜检测GBC-SD细胞的凋亡情况。结果 经12.5Lg/ml的DHA作用24~72小时后GBC-SD细胞的A值与对照组比较差别无统计学意义(P>0.05),光镜下细胞形态无明显改变.经25Lg/ml、50Lg/ml的DHA作用24~72小时后GBC-SD细胞的A值与对照组比较差别有统计学意义(P<0.05),光镜下见细胞皱缩、核染色质凝聚、边集。细胞经25Lg/ml、50Lg/ml的DHA作用24小时后,DNA琼脂糖凝胶电泳显示DNA裂解片段出现阶梯状条带,经AnnexinV-FITC/PI染色荧光显微镜下观察与对照组比较见较多绿色荧光。结论 DHA可以抑制人胆囊癌GBC-SD细胞系的增殖并诱导其凋亡。=关键词> 二十二碳六烯酸 人胆囊癌GBC-SD细胞 增值 细胞凋亡TheinhibitoryeffectofdocosahexaenicacidonthegrowthofhumangallbladdercarcinomaGBC-SDcellline ZHUKai-cheng,etal.

221000China)=Abstract> Objective Toinvestigatetheeffectofdocosahexaenicacid(DHA)s Bycellsculturinginvitro,thehumangallbladdercarcinomaGBC-SDcellsoflogarithmicgrowthphasewasculturedinRPMI1640mediumsupplementedwithDHAatconcentration12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ncubationfrom24hto72h,cellviabilityandproliferationwasdeterminedbyMTTcolourimetricassay,egelelectrophoresisandstainedbyAnnexinV-FITC/s Afterincubationwith12.5ug/mlDHAfor24h,48hand72h,theabsorbanceofGBC-SDcellswasnotaffected,tncubationwith25ug/ml、50ug/mlDHAfor24h,48hand72h,theabsorbanceofGBC-SDcellswasinhibitedsignificantly,celncubationwith25ug/ml、50ug/mlDHAfor24h,ncubationwith25ug/ml、50ug/mlDHAfor24h,GBC-SDcellstainedbyAnnexinV-FITC/PI,sions DHAcaninhibitthegrowthofhumangallbladdercarcinomaGBC-SDcelllineandinducetheapoptosis.=Keywords> Docosahexaenicacid HumangallbladdercarcinomaGBC-SDcell Proliferation

Apoptosis 二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)属于n-3多不饱和脂肪酸(n-3polyunsaturatedfattyacid,n-3PUFA),是一类主要来源于海水鱼油的重要多不饱和脂肪酸,还包括二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid,EPA)。国内外文献报道n-3多不饱和脂肪酸具有抗肿瘤作用。有关n作者单位:徐州医学院第二附属医院普外科(江苏)通讯作者:王建,E-mail:lm5651357@邮 编 221000 收稿日期 2008-12-03(TheSecondAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou-3PUFA与乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌等恶性肿瘤的研究报道较多,但未见其与胆囊癌的研究报道。本研究以人胆囊癌GBC-SD细胞系为研究对象,观察DHA对其生长的影响。1 材料与方法1.1 材料 DHA购自NU-CHEK公司,纯度大于99%,人胆囊癌GBC-SD细胞系由徐州医学院附院中心实验室冻存提供,MTT细胞增殖检测试剂盒、DNAladder抽提试剂盒、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生

齐齐哈尔医学院学报2008年第30卷第5期#525#育4小时,用0.5ml酚-氯仿-异戊醇(25B24B1)和氯仿-异戊醇各抽提一次加50Ll的3mol/L乙酸钠和2ml预冷无水乙醇,置液氮10min,12000rpm离心10min,弃上清,真空抽干,加100LlTE缓冲液溶解沉淀,另加5LlRNase37e孵育1小时。最后2%琼脂糖凝胶电泳(电压50V,2h),溴化乙锭染色,凝胶成像分析仪下观察结果并照相。1.6 AnnexinV-FITC/PI染色荧光显微镜检测凋亡细胞

细胞分别经25Lg/ml、50Lg/ml的DHA作用24小时后,与对照组一起胰酶消化收集每组约1@105个重悬的细胞于离心管中,1000rpm离心5分钟,弃上清,加入195LlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞,加入5LlAnnexinV-FITC,轻轻混匀,室温避光孵育10分钟,1000rpm离心5分钟,弃上清,加入190LlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞,加入10Ll碘化丙啶染色液,轻轻混匀,1000rpm离心5分钟,弃上清,用100LlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞,涂片后荧光显微镜下观察并拍照。1.7 统计学处理 采用统计软件SPSS13.0进行统计分析,实验数据经过方差齐性检验后,进行方差分析或秩和检验,P<0.05认为差异有统计学意义。2 结果2.1 MTT实验结果 检测结果显示经12.5Lg/ml的二十二碳六烯酸(DHA)作用24~72小时后人胆囊癌GBC-SD细胞的A值与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。经25Lg/ml、50Lg/ml的二十二碳六烯酸(DHA)作用24~72小时后人胆囊癌GBC-SD细胞的A值与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。48h0.777?0.0330.784?0.0520.570?0.022*0.329?0.015*72h0.828?0.0270.833?0.0730.601?0.042*0.486?0.015*物技术研究所。RPMI1640培养基、胰酶购自南京凯基生物公司,胎牛血清购自杭州四季清生物公司。1.2 细胞培养 人胆囊癌GBC-SD细胞培养于含20%胎牛血清,100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI1640培养基,5%CO2,饱和湿度,37e,细胞呈单层贴壁生长,每2~3天更换培养基一次,待生长至80%~90%融合时,用0.25%胰酶消化细胞传代培养。1.3 细胞增殖测定 采用MTT法测定DHA对人胆囊癌GBC-SD细胞增殖的影响。用RPMI1640培养剂稀释DHA配制成不同浓度并将无水乙醇终浓度控制在0.5%以下。细胞以1@105/ml浓度接种于96孔培养板,每孔100Ll,培养24小时待细胞贴壁后,分别加入DHA终浓度为12.5Lg/ml、25Lg/ml、50Lg/ml的培养液,每孔终体积为200Ll,对照组加入等量培养液和无水乙醇,不含DHA并将各组无水乙醇终浓度控制在0.5%以下,每组设3个平行孔。分别培养24、48、72小时后,每孔加入5mg/ml的四甲基偶氮唑蓝(MTT)20Ll,继续孵育4小时至结晶析出,弃去上清,加入DMSO100Ll,微振荡10min,使孔底的结晶物充分溶解,酶标仪570nm波长处测定每孔吸光度(A)值率。1.4 细胞形态学观察 人胆囊癌GBC-SD细胞经DHA处理后定时置于倒置显微镜下观察。1.5 DNA凝胶电泳 细胞分别经25Lg/ml、50Lg/ml的DHA作用24小时后,与对照组一起胰酶消化收集每组约2@106个细胞,离心,弃上清,加细胞核裂解液500Ll(100mmol/LTris-HCL,pH8.0,150mmol/lNaCl,10mmol/LEDTA,0.4%SDS),加终浓度100Lg/ml的蛋白酶K,50e孵组别对照组12.5Lg/mlDHA组25Lg/mlDHA组50Lg/mlDHA组 注:与对照组比较,*P<0.05。24h0.594?0.0300.598?0.0440.514?0.032*0.324?0.053*表1 不同浓度和时间点的DHA对GBC-SD细胞增殖的影响 (A值,x?s)2.2 细胞形态学观察结果 经25Lg/ml、50Lg/ml的二十二碳六烯酸作用24~72小时后,光镜下见细胞皱缩、核染色质凝聚、边集,见图1。条带,见图2。a ba:对照组 b:50Lg/mlDHA组图1 作用48h后倒置显微镜下细胞形态(@100)M:Marker;1.对照组;2.25Lg/mlDHA组;3.50Lg/mlDHA组图2 作用24h后DNA凝胶电泳结果2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳结果 经25Lg/ml、50Lg/ml的DHA作用24小时后,细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示DNA裂解片段出现阶梯状条带,对照组仅在加样孔附近见一宽厚2.4 AnnexinV-FITC/PI染色荧光显微镜检测结果 经25Lg/ml、50Lg/ml的二十二碳六烯酸作用24小时后,GBC

#526#-SD细胞经AnnexinV-FITC/PI染色荧光显微镜下观察与对照组比较见较多绿色荧光,见图3。JournalofQiqiharMedicalCollege,2009,Vol.30,No.5细胞经终浓度为25Lg/ml、50Lg/ml的DHA作用24~72小时后,光镜下见细胞皱缩、核染色质凝聚、边集。经25Lg/ml、50Lg/ml的DHA作用24小时后,细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示DNA裂解片段出现阶梯状条带,经AnnexinV-FITC/PI染色荧光显微镜下观察与对照组比较见较多绿色荧光。这些均说明DHA可以诱导人胆囊癌GBC-SD细胞凋亡。楼健颖等研究发现在体外对胃癌细胞AGS产生明显增殖抑制作用的DHA浓度却未对正常肠上皮细胞产生增殖抑制作用[9]。可见DHA的毒副作用相对小,应该有着较好的a ba:对照组 b:50Lg/mlDHA组图3 作用24h后AnnexinV-FITC/PI染色荧光显微镜结果(@100)临床应用前景。本实验初步显示DHA可以抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的增殖并诱导其凋亡,应该进一步深入研究其作用及机制,从而为DHA用于胆囊癌的治疗提供依据。参 考 文 献[1] TodorokiT,KawamotoT,TakahashiH,entofgallbladdercancerbyradicalresection[J].JSurg,1999,86:622-627[2] AronsonWJ,GlaspyJA,ReddyST,tionofomega-3/omega-6polyunsaturatedratioswithdietaryfishoilsinmenwithprostatecancer[J].Urology,2001,58(2):283-288[3] PrattVC,WatanabeS,BrueraE,andneutrophilfattyacidcompositioninadvancedcancerpatientsandresponsetofishoilsupplementation[J].BrJCancer,2002,87:1370-1378[4] KleinV,ChajesV,GermainE,ha-linolenicacidcontentofadoiposebreasttissueisassociatedwithanincreasedriskofbreastcancer[J].EuroJCancer,2000,36:335-340[5] RoseDP,soffattyacidsandinhibitorsofEicosanoidsynthesisonthegrowthofahumanbreastcancercelllineinculture[J].CancerRes,1990,50:7139-7144[6] GrammatikosSI,SubbaiahPV,VictorTA,etal.n-3andn-6fattyacidProcessingandgrowtheffectsinneoplasticandnon-canceroushumanmammaryepithelialcelllines[J].BrJCancer,1994,70:219-227[7] AritaK,KobuchiH,UtsumiT,ismofapoptosisinHL-60cellsinducedbyn-3andn-6polyunsaturatedfattyacids[J].BiochemPharmacol,2001,62(7):821-827[8] 巩涛,李勇,郭建文,等.w-3多不饱和脂肪酸对人胃癌BGC-823细胞周期及凋亡的影响[J].中国临床营养杂志,2006,14(2):77-81[9] 楼健颖,吴丹,林汉庭,等.w-3多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸对胃癌细胞株AGS生长和增殖的影响[J].中华普通外科杂志,2007,22(8):613-6153 讨论原发性胆囊癌是胆道系统中常见的恶性肿瘤,占胆道疾患的0.96%~4.9%,临床表现缺乏特异性,恶性程度较高,早期诊断率及手术切除率低,预后差[1]。胆囊癌对目前各种放化疗均不敏感,因此需要寻找治疗胆囊癌的新的方法。二十二碳六烯酸(DHA)是n-3多不饱和脂肪酸的一种,是人体必需的营养成分之一,也是参与细胞膜磷脂构成和细胞内代谢调控的重要结构脂肪酸。近年来研究发现,肿瘤患者存在细胞膜磷脂构成的改变和结构脂肪酸失衡或缺乏[2-切[4]。本实验以人胆囊癌GBC-SD细胞为研究对象,结果显示,终浓度为25Lg/ml、50Lg/ml的DHA在体外作用GBC-SD细胞24~72小时后均能明显地抑制细胞的增殖。Rose等在体外实验中发现在培养剂中添加DHA可使MDA-MB-231乳腺癌细胞数下降50%,台盼蓝染色显示细胞并未出现死亡,提示DHA可能通过抑制有丝分裂而并非细胞毒作用导致细胞数下降[5]。Grallnnat1kos等在雌激素依赖的MCF-7乳腺癌细胞株上也观察到类似结果[6]。当然在大剂量的n-3PUFA作用下亦可产生细胞毒作用。近年的研究表明,n-3PUFA可能通过多种途径抑制肿瘤细胞的生长和转移。诱导肿瘤细胞凋亡是DHA抗肿瘤的机制之一。Arita等发现经60~120Lmol/lEPA处理的人急性早幼粒白血病HL-60细胞,经过6~12h后可以出现具有凋亡特征的DNA片段,这种诱导效应具有时间、剂量关系[7]3]。体内n-3多不饱和脂肪酸的低水平与肿瘤的发生,发展关系密。巩涛等用EPA或DHA作用于人胃癌BGC-823细胞系后Ho-echst33258染色可见核固缩,边集成新月状,凋亡小体或核破碎,透射电镜观察也可见凋亡现象[8]。本实验中GBC-SD